[發明專利]一種基于雙滾環分離檢測外泌體的光學生物傳感器

在審

• 申請號: 202210241161.4
• 申請日: 2022-03-11
• 公開（公告）號: CN114609104A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 王玉;朱鏡儒;黃加棟;劉素;郭志強;李倩茹;姚玉穎;李宗強;李靜靜;張清心;徐婉晴;朱志學
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 牛芳

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種基于雙滾環分離檢測外泌體的生物傳感器，包括：核苷酸序列如SEQ NO:1?10所示的模板CT1，模板CT2，Connector，DNA?chol，CP1，CP2，發夾探針H1，發夾探針H2，Reporter，crRNA，和Cas12a、T4 DNA連接酶；所述DNA?chol的3’端修飾膽固醇；所述Reporter的5’端和3’端分別連接熒光報告基團和熒光猝滅基團。該傳感器具有檢測速度快、操作簡單、價格低廉、檢測限低、特異性高等優點。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種基于雙滾環分離檢測外泌體的生物傳感器及其制備方法。

背景技術

外泌體是一種直徑為30~100 nm、密度為1.10~1.18 Kg/L的由細胞分泌的膜性囊泡小體。外泌體能夠與受體細胞結合，參與細胞間物質交換和信息交流。外泌體中所含有的與腫瘤相關的蛋白，核酸，小分子等，都有潛力成為潛在的生物標志物。腫瘤細胞分泌的外泌體的含量在血液中的含量很高，每毫升血液中含有超過10⁹個外泌體，以利用外泌體作為生物標志物進行檢測會有更高的靈敏度，有助于癌癥的早期檢測。常見的檢測外泌體的方法包括Wsetern blot、ELISA等，但這些方法的操作太過繁瑣，限制了快速檢測外泌體的應用。因此急需一種簡單快速的分析方法來對外泌體進行檢測。

CRISPR-Cas作為一種自適應免疫系統，近年來被發現Cas12a在特異性識別DNA之后表現出非特異性降解即反式切割的活性，有望成為快速、準確的診斷工具。近幾年，DNA生物傳感檢測技術憑借其高靈敏性和特異性得到廣泛的關注，尤其其中的光生物傳感器具有靈敏度高、價格低廉等的優勢。

發明內容

針對現有方法中的操作過程繁瑣、價格昂貴等的問題，提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于CRISPR系統的檢測外泌體的生物傳感器。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案。

一種基于雙滾環分離檢測外泌體的生物傳感器，包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-10所示的模板CT1，模板CT2，Connector，DNA-chol，CP1，CP2，發夾探針H1，發夾探針H2，Reporter，crRNA，和Cas12a、T4 DNA連接酶；

所述DNA-chol的3’端修飾膽固醇；

所述Reporter的5’端和3’端分別連接熒光報告基團和熒光猝滅基團。

優選地，所述滾環模板CT1、滾環模板CT2和T4 DNA連接酶用RCA1和RCA2代替，所述RCA1和RCA2的序列如SEQ ID NO: 12-13所示。

一種包含上述生物傳感器的試劑盒。

優選地，所述試劑盒還包括緩沖溶液。

一種上述生物傳感器或試劑盒檢測外泌體的方法，包括以下步驟：

（1）將滾環模板CT1和滾環模板CT2分別與primer混合在T4 DNA連接酶催化下制備滾環1和滾環2；

（2）將滾環1或滾環2在phi29聚合酶催化下以dNTP為底物制備RCA1或RCA2；

（3）將RCA1、RCA2、待測樣品或外泌體標準品、DNA-chol、Connector混合，調節pH至6.0；然后加入發夾探針H1、發夾探針H2、Cas12a、crRNA和Reporter，混合均勻后孵育，檢測熒光。

所述primer的序列如SEQ ID NO: 11所示。