[發(fā)明專利]紋狀體類腦器官及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210238261.1
• 申請(qǐng)日: 2022-03-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114457015A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王濤;吳孟華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079;C12N5/071;C12N5/0735;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州廣典知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44365
• 代理人: 顧書(shū)玲;萬(wàn)志香

本發(fā)明涉及一種紋狀體類腦器官及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用紋狀體發(fā)育過(guò)程中經(jīng)典的Sonic hedgehog信號(hào)通路的激活來(lái)產(chǎn)生類器官，誘導(dǎo)三維分化體系中人胚胎干細(xì)胞向紋狀體類腦器官分化，在培養(yǎng)過(guò)程中，在所述培養(yǎng)基加入適量的SHH，能夠成功獲得長(zhǎng)期存活、類似于體內(nèi)早期發(fā)育過(guò)程中的紋狀體原基、具有相應(yīng)生物性能的紋狀體類腦器官，其在篩選藥物、疾病研究或臨床研究上具有廣泛的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一紋狀體類腦器官及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

人胚胎干細(xì)胞具有多能性，具有分化為任何胚層細(xì)胞類型的能力。近年來(lái)，人胚胎干細(xì)胞被報(bào)道能夠自我組裝形成三維類器官結(jié)構(gòu)，例如肝臟、腎臟、小腸、心臟；以及大腦的特定區(qū)域前腦、中腦、海馬、下丘腦、視網(wǎng)膜。這些類器官能夠很好地模擬人類的發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞組成及結(jié)構(gòu)，為研究細(xì)胞命運(yùn)特化、模擬細(xì)胞-細(xì)胞相互作用關(guān)系以及探究疾病機(jī)理提供了相對(duì)理想可靠的模型和藥物篩選平臺(tái)。

紋狀體類器官在發(fā)育模型和藥物篩選方面具有很大的發(fā)展?jié)摿?，開(kāi)發(fā)多種不同的培養(yǎng)體系來(lái)產(chǎn)生紋狀體類腦器官是很有必要的。但是目前很少文獻(xiàn)報(bào)道紋狀體三維類腦器官生成方案，并且采用的是激活發(fā)育過(guò)程中的ActivinA和視黃醇類X受體信號(hào)通路的方式來(lái)產(chǎn)生紋狀體類腦器官[Miura Y,Li MY,Birey F,Ikeda K,Revah O,Thete MV,Park JY,Puno A,Lee SH,Porteus MH,Pasca SP.Generation of human striatal organoids andcortico-striatal assembloids from human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol2020,38(12):1421-1430.]。

因此，我們通過(guò)合適的順序暴露人胚胎干細(xì)胞于紋狀體發(fā)育過(guò)程中的生長(zhǎng)因子、化學(xué)小分子激活劑和抑制劑，開(kāi)發(fā)新的可以在體外產(chǎn)生類似發(fā)育過(guò)程中形成的紋狀體類器官培養(yǎng)體系。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的是提供一種紋狀體類腦器官的培養(yǎng)方法，以及培養(yǎng)基，通過(guò)這些培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，可以成功獲得可長(zhǎng)期培養(yǎng)的紋狀體類腦器官。

包括技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的之一，在于提供一種誘導(dǎo)紋狀體類腦器官產(chǎn)生的培養(yǎng)基。

一種誘導(dǎo)紋狀體類腦器官產(chǎn)生的培養(yǎng)基，其為在PM培養(yǎng)液中添加有SHH因子。

在其中一些實(shí)施例中，所述SHH因子在PM培養(yǎng)液中的濃度為200±50ng/ml。

在其中一些實(shí)施例中，所述SHH因子在PM培養(yǎng)液中的濃度為200±5ng/ml，在其中一優(yōu)選實(shí)施例中為200±1ng/ml，更優(yōu)選為200ng/ml。

在其中一些實(shí)施例中，PM培養(yǎng)液為含有以下濃度的成分1±0.1％(v/v)N2添加劑,2±0.2％(v/v)B27無(wú)維生素A，0.15±0.02％(w/v)葡萄糖及100±5uMβ-巰基乙醇的DMEM/F12培養(yǎng)基中。

本發(fā)明的目的之二，在于提供一種紋狀體類腦器官的培養(yǎng)方法。

一種紋狀體類腦器官的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

S1.使用細(xì)胞消化液Accutase孵育人胚胎干細(xì)胞(hESC)后，將hESC解離成單細(xì)胞懸液，在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基NIM中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔45-52小時(shí)更換新的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基NIM；

S2.在培養(yǎng)10±0.5天時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到低吸附的孔板中，換成上述誘導(dǎo)紋狀體類腦器官產(chǎn)生的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；每隔45-52小時(shí)更換新的述誘導(dǎo)紋狀體類腦器官產(chǎn)生的培養(yǎng)基，直到分化第18±0.5天；

S3.然后將細(xì)胞更換到新的DM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，即得所述紋狀體類腦器官。