[發明專利]一種神經干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法

在審

• 申請號: 202210237662.5
• 申請日: 2022-03-11
• 公開（公告）號: CN114621923A
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 朱劍虹;謝強;陳柯竹;李天文;湯奇勝
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院;朱劍虹
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/079;C12N5/09;A61K35/13;A61K35/30
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

一種神經干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，以神經干細胞或Neuro2a為來源細胞，經過分離、培養，提取出可供移植的線粒體，并對神經干細胞和Neuro2a細胞來源的線粒體進行質量檢測，線粒體具有正常的膜電位，形態為棒狀并連接成網，能夠維持一定的膜電位，最大OCR較基礎OCR有較高漲幅，線粒體氧化呼吸儲備能力充足，氧化呼吸功能保存良好，獲得的線粒體能夠從腦室進入到腦實質，小鼠來源的線粒體能夠跨物種轉移到活體動物的細胞內，移植后能進入到神經元細胞內，并發揮減少梗死面積、促進行為學改善的作用。

技術領域

本發明屬于線粒體制備領域，具體涉及一種神經干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法。

背景技術

腦卒中是全球第二致死原因及首要致殘原因，2017年，腦卒中是中國首位致死因素以及首位致殘因素。腦卒中是一種由腦血管突然閉塞和/或破裂導致神經功能障礙的急性腦血管疾病，主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類。

缺血性腦卒中占腦卒中的比例更高，其致死率和致殘率高，造成巨大的社會和個人負擔。缺血-再灌注是一個很常見的病理生理過程，除了在缺血性腦卒中和心肌梗死血管再通治療過程中可見外，還常常見于器官移植、低血容量休克等情況，在缺血性腦卒中的治療過程中，常見腦缺血-再灌注損傷。

腦組織缺血時，會出現一系列病理生理改變，但其核心是線粒體的功能障礙，細胞正常的代謝，氧化磷酸化、氧化呼吸不能進行，產生的能量不足使其維持正常的生命活動，導致細胞凋亡壞死。

有研究表明，缺血-再灌注損傷的始動核心是線粒體。在缺血期間，呼吸鏈、氧化還原活性酶和電子載體庫(如NADH和輔酶Q)最大限度地減少。同時，由于ATP耗竭、缺乏離子穩態、鈣超載和pH變化等因素，線粒體逐漸被抑制。因此，當缺血組織被富含氧氣的血液再次灌注時，線粒體組分會將電子不適當地轉移到氧氣上，產生大量的活性氧簇(ReactiveOxygen Species，ROS)，造成后續的病理改變，導致細胞的凋亡、壞死。

目前缺血性腦卒中的治療方法主要包括血管再通治療(取栓、溶栓等)、抗凝、抗血小板、神經保護等治療。早期治療中又以血管再通治療最為重要，及時地再通阻塞的腦血管能夠最大程度地改善神經功能障礙。然而，再通的血流可能會進一步地造成嚴重的損傷。目前的治療策略大多聚焦于減輕缺血-再灌注后的損傷，如減少ROS的產生、減輕鈣離子超載、抗凋亡等治療策略，但這些效果有限。針對腦缺血-再灌注損傷的研究已經很多，但是目前仍然沒有一個具有確切臨床效果的藥物或者方法。因此，有必要進一步開發新的治療手段。

聚焦于線粒體本身，改善受損線粒體功能的狀態，是改善腦缺血損傷的一個重要方向。線粒體除了作為細胞的能量工廠為細胞提供大量能量之外，還與鈣平衡、細胞凋亡、ROS產生、代謝物合成、激素合成、細胞分化等相關。

以前的研究主要將線粒體作為一個干預的靶點或者觀察的對象，近年來已經有研究將提取的線粒體作為一種干預手段去治療某些疾病，如利用線粒體治療肺動脈高壓，治療心肌缺血再灌注損傷，治療肝臟的缺血再灌注損傷，治療脂肪肝，修復神經等等。但線粒體治療腦缺血再灌注損傷更關注改善局部能量代謝的作用，對炎癥的調節作用次之。

由于恢復線粒體的功能對改善腦缺血后的損傷反應至關重要，因此，利用線粒體治療腦缺血-再灌注損傷有較強的理論基礎。然而，在利用線粒體治療疾病時，需要解決的最基本的問題之一為線粒體的來源問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種神經干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，制備的線粒體為棒狀形態并連接成網，能夠維持一定的膜電位，最大OCR較基礎OCR有較高漲幅，線粒體氧化呼吸儲備能力充足，氧化呼吸功能保存良好，獲得的線粒體能夠從腦室進入到腦實質，小鼠來源的線粒體能夠跨物種轉移到活體動物的細胞內，移植后能進入到神經元細胞內，發揮減少梗死面積、促進行為學改善的作用。

為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案：