[發(fā)明專利]一種神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法

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• 申請日: 2022-03-11
• 公開（公告）號: CN114621923A
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱劍虹;謝強;陳柯竹;李天文;湯奇勝
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院;朱劍虹
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/079;C12N5/09;A61K35/13;A61K35/30
• 代理公司: 上海開祺知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，包括以下步驟：

1)分離及培養(yǎng)細胞系

分離新生小鼠的神經(jīng)干細胞，加入適量神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基進行重懸、過濾，分裝后進行懸浮培養(yǎng)，3-4天半量或全量換液，神經(jīng)球直徑為100-200μm時進行傳代，傳代時取細胞懸液，靜置后待細胞自然沉降，去除上清液，加入Accutase酶，室溫孵育8-12min，搖晃、離心，棄去上清液，用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基重懸，傳代5-10代內(nèi)的神經(jīng)球用于提取線粒體；

或從小鼠神經(jīng)母細胞瘤分離出Neuro2a細胞，形態(tài)呈神經(jīng)元樣或阿米巴樣，使用含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2-3天待培養(yǎng)液變黃時換液，當(dāng)細胞匯合度在70％-90％時進行傳代、凍存或干預(yù)；

2)提取線粒體

利用線粒體提取試劑盒對培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞進行提取：用胰酶消化生長狀態(tài)良好、形態(tài)正常的待提取細胞，消化后收集細胞并用預(yù)處理試劑進行預(yù)處理，再加入裂解試劑進行裂解，細胞膜被裂解，釋放細胞核、細胞漿及包括線粒體在內(nèi)的細胞器，離心后得到細胞核和細胞碎片沉淀，上清中包括線粒體和細胞漿，上清中加入離心介質(zhì)后對其再離心，得到線粒體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述神經(jīng)干細胞分裝后密度為4-6×10⁵個/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，步驟1)中，神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞的培養(yǎng)條件為37℃，5％CO₂。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，步驟1)中所述神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中包括：DMEM/F12培養(yǎng)基，添加了營養(yǎng)因子B27 1.5-2.5ml/100ml、N2 0.5-1.5ml/100ml和青霉素/鏈霉素雙抗。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，在提取線粒體前，還包括線粒體檢測步驟，利用熒光染色法檢測待提取線粒體的形態(tài)；檢測神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞中的線粒體膜電位；以活細胞的耗氧率來判定線粒體呼吸功能情況。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，所述待提取線粒體的形態(tài)檢測過程為：將神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞制成單細胞懸液后接種于共聚焦皿以Matrigel預(yù)處理1小時，用MitoTracker Red工作液培養(yǎng)，以hoechst33342染料對貼壁細胞內(nèi)的線粒體染色，共聚焦顯微鏡下檢測觀察、拍照。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，在線粒體膜電位的檢測過程中，包括以下步驟：消化細胞，分別制備神經(jīng)干細胞單細胞及Neuro2a細胞單細胞懸液，以JC-1染料將mNSC細胞及Neuro2a細胞的線粒體進行染色，經(jīng)JC-1染色后利用流式細胞學(xué)法檢測神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞中的線粒體膜電位。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，制備的單細胞懸液中包括了培養(yǎng)基和相應(yīng)細胞，所述單細胞懸液中細胞的接種密度為4-6×10⁵/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述神經(jīng)干細胞或Neuro2a細胞來源線粒體的制備方法，其特征在于，步驟2)中，待提取細胞為小鼠神經(jīng)干細胞時，神經(jīng)球的直徑為100-200μm。