[發明專利]烯還原酶突變體、工程菌及其制備(2R,5R)-二氫香芹酮的應用

有效

• 申請號: 202210233537.7
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114540319B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 吳石金;邱樂泉;王碧嬌;李彤彤;鄢洪德
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/26;C12P41/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 李世玉

本發明公開了一種烯還原酶突變體、工程菌及其制備(2R,5R)?二氫香芹酮的應用，以烯還原酶突變體純酶為催化劑，以(5R)?香芹酮為底物，以NAD(P)+為輔因子，以醇脫氫酶或葡萄糖脫氫酶為輔酶，以異丙醇或葡萄糖為輔助底物，以pH?8.0?10.0的緩沖液為反應介質構成反應體系，在30?40℃，180?250rpm轉速的搖床中反應完全后，反應液分離純化，獲得(2R,5R)?二氫香芹酮。本發明突變烯還原酶GsOYE?R13不對稱還原(5R)?香芹酮生產(2R,5R)?二氫香芹酮的產率提高至99％以上，de_p值提高至99％以上(2R,5R)。

(一)技術領域

本發明涉及一種烯還原酶突變體，具體涉及一種烯還原酶突變體GsOYE-R13及其編碼基因，含有該突變體編碼基因的質粒及重組菌，以及該烯還原酶突變體GsOYE-R13在催化(5R)-香芹酮制備手性化合物(2R,5R)-二氫香芹酮中的應用。

(二)背景技術

烯還原酶(EC1.6.99.1)屬于氧化還原酶，能催化活化烯烴的不對稱還原，其在加氫的同時可以引進一個或兩個手性中心，對α,β不飽和酮、醛、硝基烯烴和羧酸的催化還原有立體選擇性和對映選擇性。烯還原酶的基本結構單位是由TIM桶中間含有FMN，是NAD(P)H依賴性氧化還原酶。烯還原酶活性中心區域的組氨酸和天冬酰胺殘基在底物不對稱還原中起著重要作用。

與化學水解法相比生物轉化法具有效率高、條件溫和、環境污染小、并能在無額外引入保護/修飾基團的情況下實現化學、區域和對映體選擇性等優點。為了在工業上利用烯還原酶催化生產α、β不飽和酮、醛類化合物，降低該酶的制造成本尤為重要。具體而言，必須提高單位重量酶制備物中烯還原酶的含量。隨著生物技術的迅速發展，用基因工程技術手段來構建具有烯還原酶活性的基因重組菌株可以用來克服上述的缺點。此外，利用基因重組菌來表達烯還原酶可以定向改造烯還原酶，以避免催化反應過程中副反應的發生，并提高產物產量。相比于化學合成法使用高溫及價格較為昂貴的金屬催化劑等，生物酶催化操作簡單，對映體選擇性高，收率高，成本低，安全環保，解決化學法能耗高、污染大、操作繁瑣等問題。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種烯還原酶突變體GsOYE-R13，含有該突變體編碼基因的質粒及重組基因工程菌，以及該烯還原酶突變體GsOYE-R13在催化(5R)-香芹酮制備手性化合物(2R,5R)-二氫香芹酮中的應用，有效提高了產物對映體選擇性和產率。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種烯還原酶突變體(GsOYE)，所述烯還原酶突變體是將SEQ?ID?NO.3所示氨基酸序列第270位進行定點突變獲得的，優選所述烯還原酶突變體是將SEQ?ID?NO.3所示氨基酸序列第270位天冬酰胺突變為丙氨酸，記為GsOYE-R13，氨基酸序列如SEQ?IDNO.1所示。

SEQ?ID?NO.1：

MLKLLEPFDLNGLELANRMVMAPLTRNRAGPRFVPTKMNALYYAQRSGLGLIITEATQISQQGMGYPDTPGIYTDEQVDGWRMVTEAVHRREGCIFLQLWHVGRVSHSSFQPNGQLPVAPSAIAPEGEVMTYDGIKPFETPRALETEEVAHIVEDYRKAAINAKRAGFDGIEIHSANGYLLHEFLEDGTNKRTDRYGGSIENRTRIVFEVLDAVCKVYPSRRVGIRLSPDTEFMSMSDSDRPALYSYLVQELSRRELAYLHLIEPRIKGAVDVEKESSLNVEFFRPLYKGVLITAGGYQKETGEERLQKQHADLVAYGRWVIANPDLPSRFEQNAPLNPYDRATFYGGNEKGYTDYPFLDPRDSQEALKEAEAAERKWRRL。

本發明還提供一種所述烯還原酶突變體編碼基因，記為Gasu-R13，編碼基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

SEQ?ID?NO.2：