[發(fā)明專利]烯還原酶突變體、工程菌及其制備(2R,5R)-二氫香芹酮的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210233537.7
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114540319B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳石金;邱樂泉;王碧嬌;李彤彤;鄢洪德
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/26;C12P41/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 李世玉

1.一種烯還原酶突變體，其特征在于所述烯還原酶突變體氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種權(quán)利要求1所述烯還原酶突變體的編碼基因。

3.一種含權(quán)利要求2所述編碼基因的重組基因工程菌。

4.一種權(quán)利要求1所述烯還原酶突變體在催化(5R)-香芹酮制備手性化合物(2R,5R)-二氫香芹酮中的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：將含烯還原酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎，取破碎混合液離心的上清液或上清液提取的純酶為催化劑，以(5R)-香芹酮為底物，以NAD(P)+為輔因子，以醇脫氫酶或葡萄糖脫氫酶為輔酶，以異丙醇或葡萄糖為輔助底物，以pH?8.0-10.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在30-40℃，180-250rpm轉(zhuǎn)速的搖床中反應(yīng)完全后，反應(yīng)液分離純化，獲得手性產(chǎn)物(2R,5R)-二氫香芹酮。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系中，催化劑用量以蛋白含量計為0.1-5mg/mL，所述底物加入終濃度2-20mM，所述NAD(P)⁺加入終濃度0.05-0.2mM，所述輔酶加入終濃度0.2-2U/mL，所述輔助底物加入終濃度為30-100mM。

7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系為：以所述上清液或純酶為催化劑，以(5R)-香芹酮為底物，以NAD(P)⁺為輔因子，以葡萄糖脫氫酶為輔酶，以葡萄糖為輔助底物，以50mM、pH?8.0的PBS緩沖液構(gòu)成。

8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述上清液按如下方法制備：(1)將含烯還原酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種于含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16h；再將菌液以體積濃度1％的接種量接種至新鮮的含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至OD_600nm達(dá)到0.6-0.8；向培養(yǎng)液中加入終濃度0.2mM的IPTG，于25℃，180rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)12h，1,0000rpm離心10min，收集菌體后用PBS緩沖液懸浮菌體；(2)將步驟(1)的菌體懸浮液于4℃低溫冰水浴下超聲波破碎菌體，超聲波破碎條件為：功率250W，3s開，4s關(guān)，溫度為4℃，有效破碎時間為10min；超聲波破碎混合液經(jīng)15,000rpm離心25min后，吸取上清，獲得含有目的烯還原酶突變體的粗酶液。

9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述純酶采用Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化柱按如下方法制備：①平衡重力柱：用結(jié)合緩沖液沖洗柱子，洗脫2個柱體積；結(jié)合緩沖液：10mM咪唑，0.5mM?NaCL，20mM?NaH₂PO₄，pH?7.9～8.1；②樣品液上柱：將收集的粗酶液按體積比1:1加入結(jié)合緩沖液混勻后，上樣，上樣量為4個柱體積，每次上樣1個柱體積；③洗柱：用結(jié)合緩沖液洗脫至280nm處吸光度接近基線；④洗脫：用洗脫緩沖洗脫3次，每次洗脫1個柱體積，重力自然流出，分別收集每次的流出液，取第2次的流出液濃縮并用超濾管脫鹽，獲得所述的純酶；所述洗脫緩沖液：250mM咪唑，0.5mM?NaCL，20mM?NaH₂PO₄，pH?7.9～8.1。