[發(fā)明專(zhuān)利]一種產(chǎn)順-11-十六碳烯醛破囊壺菌菌株的培育方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210226077.5
• 申請(qǐng)日: 2022-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114672422A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡永紅;楊晶晶;崔子龍;趙芷若;郭宏康;葉競(jìng)靈;王志;汪婷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/14;C12P7/24;C12R1/645
• 代理公司: 南京天華專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

本發(fā)明一種產(chǎn)順?11?十六碳烯醛破囊壺菌菌株的培育方法，具體步驟如下：(1)制備菌懸液；(2)在無(wú)菌條件下，取菌懸液均勻平鋪在固體培養(yǎng)皿中，進(jìn)行氮離子注入誘變；(3)將經(jīng)過(guò)氮離子注入誘變的菌液進(jìn)行稀釋?zhuān)鶆蛲坎荚贛4培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)；(4)于M4平板上挑選出單菌落作為初篩菌；(5)經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，得出能夠穩(wěn)定產(chǎn)順?11?十六碳烯醛的破囊壺菌菌株。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、效率高、成本低，易于推廣。經(jīng)本發(fā)明方法獲得的菌株，較野生型破囊壺菌順?11?十六碳烯醛產(chǎn)量提高最多可達(dá)65.18％，遠(yuǎn)超同類(lèi)方法，能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)順-11-十六碳烯醛破囊壺菌菌株的培育方法，特別涉及一種破囊壺菌進(jìn)行氮離子誘變進(jìn)行選育，從而獲得高產(chǎn)菌株的方法。

技術(shù)背景

小菜蛾作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最為常見(jiàn)的害蟲(chóng)之一，廣泛分布在中國(guó)多個(gè)糧食產(chǎn)區(qū)。近年來(lái)，有許多學(xué)者鑒定出順-11-十六碳烯醛是小菜蛾信息素的主要有效成分，利用小菜蛾信息素可以高效、精準(zhǔn)的誘捕并殺死害蟲(chóng)，達(dá)到綠色防治的目的。然而，目前市場(chǎng)上多數(shù)使用化學(xué)合成法生產(chǎn)順-11-十六碳烯醛，造成了不必要的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，篩選并培育高產(chǎn)順-11-十六碳烯醛的破囊壺菌迫在眉睫。

在微生物菌種選育過(guò)程中，氮離子誘變是主要方法之一。利用簡(jiǎn)單高效的氮離子誘變技術(shù)，可以使菌株在非自然條件下大幅提高突變效率，進(jìn)而挑選出所需的高產(chǎn)菌。提高破囊壺菌的順-11-十六碳烯醛產(chǎn)量可以大幅提高發(fā)酵效率，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)于培育破囊壺菌產(chǎn)脂肪酸的方法有很多，如專(zhuān)利(CN201811209492.X)采用紫外光誘變破囊壺菌使其高產(chǎn)二十二碳六烯酸，雖然操作簡(jiǎn)單、成本低，但是有利變異少，誘變的方向和性質(zhì)不能控制；或如專(zhuān)利(CN201911192842.0)通過(guò)改良破囊壺菌液體MP培養(yǎng)基及破囊壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)達(dá)到高產(chǎn)脂肪酸的目的，雖然培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，能源利用高，利于工業(yè)化生產(chǎn)，但是所產(chǎn)總脂肪酸含量不高，且棕櫚酸和DHA的含量均低于0.6g/L；或如專(zhuān)利(201911104758.9)中采用化學(xué)合成法合成順-11-十六碳烯醛，雖然操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，但是所產(chǎn)生的副產(chǎn)物會(huì)造成污染，不如生物制備法綠色安全。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)順-11-十六碳烯醛破囊壺菌菌株的培育方法，突破微生物法產(chǎn)順-11-十六碳烯的產(chǎn)量瓶頸。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：一種產(chǎn)順-11-十六碳烯醛破囊壺菌菌株的培育方法，其具體步驟如下：

(1)取破囊壺菌于活化培養(yǎng)基中得活化菌液，將活化后的菌液離心，去除上清液，用無(wú)菌生理鹽水將菌體懸浮，獲得細(xì)胞濃度在10⁷～10⁹CFU/mL的菌懸液；

(2)在無(wú)菌條件下，取步驟(1)獲得的菌懸液均勻平鋪在固體培養(yǎng)皿中，平鋪量為1.5～2mL/cm²，進(jìn)行氮離子注入誘變，注入能量為20～40keV，氮離子注入量為5～50×10¹⁴ions/cm²；

(3)將步驟(2)中經(jīng)過(guò)氮離子注入誘變的菌液用無(wú)菌生理鹽水稀釋體積50～150倍，取稀釋后的菌液均勻涂布在M4固體平板培養(yǎng)基上，涂布的量為50～100μL/cm²，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)于M4平板上挑選出單菌落作為初篩菌；

(5)將步驟(4)中獲得的初篩菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到能穩(wěn)定產(chǎn)順-11-十六碳烯醛的破囊壺菌菌株。

優(yōu)選步驟(1)中所述的活化培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖50～55g/L、無(wú)水乙醇5～8g/L，酵母提取物2～3g/L、K₂HPO₄ 0.2～0.3g/L，人工海鹽13～14g/L、蛋白胨0.1～0.2g/L。