[發明專利]白血病特異性樹突狀細胞來源的過表達RAE-1的外泌體無細胞疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 202210225316.5
• 申請日: 2022-03-09
• 公開（公告）號: CN114657123B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 黃寧姝;馮文莉;杜轉運
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學附屬兒童醫院
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N15/867;C12N15/31;C12N5/10;C12N5/09;A61K39/00;A61P35/02
• 代理公司: 重慶雙馬智翔專利代理事務所(普通合伙) 50241
• 代理人: 方洪

本發明公開了一種白血病特異性樹突狀細胞來源的過表達RAE?1的外泌體無細胞疫苗，是將過表達RAE?1的CML細胞裂解得到的腫瘤細胞裂解物與樹突狀細胞共培養得到成熟的樹突狀細胞，分離成熟的樹突狀細胞的外泌體，對外泌體進行純化后得到。所述疫苗的制備方法，包括步驟：1)用表達RAE?1γ的慢病毒轉染CML細胞，獲得過表達RAE?1的CML細胞CML?RAE?1；2)收集CML?RAE?1細胞，裂解，得到腫瘤細胞裂解物；3)用培養液A誘導培養樹突狀細胞，取含有樹突狀細胞的培養液A與腫瘤細胞裂解物混合共培養，用培養液B培養樹突狀細胞直至成熟；4)取培養得到的成熟樹突狀細胞提取外泌體，純化后即得。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種白血病特異性樹突狀細胞來源的過表達RAE-1的外泌體無細胞疫苗及其制備方法。

背景技術

慢性髓細胞白血病(CML)是一種來源于造血干細胞的骨髓增生性疾病，以9號染色體和22號染色體之間的典型易位為特征，這種易位產生了被稱為費城染色體的截短染色體，并產生了bcr-abl融合基因。新形成的融合基因翻譯形成了BCR-ABL融合蛋白，其具有很強的酪氨酸激酶活性導致了CML的發生和發展。雖然酪氨酸激酶抑制劑(TKI)伊馬替尼作為CML的一線治療用藥可使患者達到一般預期壽命，但仍有超過30％的患者無法達到疾病根除，或者出現耐藥或藥物不耐受。涉及Abl激酶域的點突變是主要的耐藥機制。其中，“看門人”T315I突變是最常見的突變，也是治療失敗的主要原因。雖然帕納替尼作為第三代TKI對治療T315I突變有效，但由于其明顯的毒副作用，尚未得到廣泛應用。因此，迫切需要開發新的治療策略來防止CML的進展和復發。

腫瘤免疫治療已被證明是一種有效的治療方式，并且該療法徹底改變了血液系統惡性腫瘤的治療手段。樹突狀細胞(DCs)作為抗原提呈細胞(APCs)能誘導CD8⁺細胞毒性T細胞(CTL)和CD4⁺輔助性T細胞(Th)的抗腫瘤反應，在偶聯先天性免疫和適應性免疫反應中發揮重要作用。盡管以DC為基礎的疫苗仍然是癌癥免疫治療的主要選擇，但僅有5-15％的患者在接種DC疫苗后出現了客觀的臨床免疫應答。以DC為基礎的疫苗的運用主要障礙之一在于腫瘤微環境介導的免疫抑制，使DC上共刺激信號的表達降低，導致CD8⁺T細胞耐受。此外，CML患者的T細胞顯著降低了T細胞抗原受體(TCR)鏈的表達，這有助于腫瘤免疫逃避。因此，以DC為基礎的疫苗對治療CML患者具有很大挑戰性。而樹突狀細胞來源的外泌體(Dex)在抗腫瘤相關免疫抑制、生物利用度和生物穩定性等方面都優于樹突狀細胞。值得注意的是，由于Dex在抗腫瘤方面具有明顯的優勢，現已成為一種新型的無細胞抗腫瘤疫苗。然而，用于靶向治療CML的Dex疫苗還尚未見報道。

DC細胞在相關刺激因子的作用下，細胞膜向內凹陷以出芽的方式形成含多個小囊泡的多泡核內體(MVEs)，MVEs與細胞膜融合后，經胞吐的作用釋放出小囊泡，形成Dex。Dex表面攜帶有功能性免疫刺激成分，包括主要組織相容性復合體I類和II類(MHC?I/MHC?II)、細胞間粘附蛋白(ICAM1)和共刺激分子如CD80、CD86等。Dex維持了親代DC細胞的抗原呈遞能力，通過表達MHC?I-肽和MHC?II-肽復合物激活抗原特異性CD8⁺?T細胞和CD4⁺?T細胞。Dex介導的T細胞活化在腫瘤免疫治療的應用中發揮著重要作用，更重要的是，Dex同時還表達了NK活化受體，能誘導NK細胞的活化。Dex的多項臨床試驗結果表明，Dex疫苗在體內安全且具有良好的耐受性。然而這些臨床試驗結果顯示，在接受Dex治療的患者體內僅觀察到較弱的腫瘤抗原特異性T細胞反應，Dex只發揮了很有限的臨床療效。缺乏有效的T細胞成熟信號和T細胞抗原的不足可能是這些臨床試驗中適應性免疫反應較差的原因。