[發明專利]白血病特異性樹突狀細胞來源的過表達RAE-1的外泌體無細胞疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 202210225316.5
• 申請日: 2022-03-09
• 公開（公告）號: CN114657123B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 黃寧姝;馮文莉;杜轉運
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學附屬兒童醫院
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N15/867;C12N15/31;C12N5/10;C12N5/09;A61K39/00;A61P35/02
• 代理公司: 重慶雙馬智翔專利代理事務所(普通合伙) 50241
• 代理人: 方洪

1.一種白血病特異性樹突狀細胞來源的過表達RAE-1的外泌體無細胞疫苗，其特征在于：是將過表達RAE-1的CML細胞裂解得到的腫瘤細胞裂解物與樹突狀細胞共培養得到成熟的樹突狀細胞，分離成熟的樹突狀細胞的外泌體，對外泌體進行純化后得到；所述過表達RAE-1的CML細胞是用表達RAE-1γ的慢病毒轉染CML細胞得到。

2.如權利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述CML細胞為T315I突變CML細胞。

3.權利要求1或2所述的疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)用表達RAE-1γ的慢病毒轉染CML細胞，獲得過表達RAE-1的CML細胞CML-RAE-1；

2)收集CML-RAE-1細胞，裂解，得到腫瘤細胞裂解物；

3)用培養液A誘導培養樹突狀細胞，培養6-8天后，取含有樹突狀細胞的培養液A與腫瘤細胞裂解物混合共培養，每1ml培養液A與80-120μg腫瘤細胞裂解物混合，共培養7-9小時后用培養液B培養樹突狀細胞直至成熟；所述培養液A為完全培養液；所述培養液B為含胎牛血清、GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培養液；

4)取培養得到的成熟樹突狀細胞提取外泌體，純化后即得。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟1)中用基于CV186載體構建的表達RAE-1γ的慢病毒轉染CML細胞。

5.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟2)中所述裂解為通過反復凍融法裂解細胞。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于：步驟2)中所述裂解的具體方法為：用液氮冷凍細胞10min，隨后在37℃恒溫水浴中解凍，解凍后再次液氮凍結細胞10min，再37℃解凍，經過總共三次重復的冷凍/解凍循環后，通過離心去除細胞碎片，隨后將上清通過0.22μm過濾器得到腫瘤細胞裂解物。

7.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟3)中含有樹突狀細胞的培養液A與腫瘤細胞裂解物在37℃、5％CO₂的條件下共培養7-9小時；

所述培養液A為含有10％胎牛血清、10ng/ml?GM-CSF、5ng/ml?IL-4的RPMI?1640培養基；

所述培養液B為含有10％胎牛血清、10ng/ml?GM-CSF、5ng/ml?IL-4、10ng/ml?TNF-α的RPMI?1640培養基。

8.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟4)中外泌體的提取方法為：取含有血清的完全培養液通過超離心去除培養液中的外泌體得到去外泌體培養基，將步驟3)培養得到的成熟樹突狀細胞用去外泌體培養基培養過夜，然后收集培養液的上清液通過離心過濾法純化。

9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述純化的具體方法為：收集培養液的上清液后以300g進行離心10分鐘以去除細胞和細胞碎片后，連續離心進一步純化：2000g離心10min，10000g離心30min，以去除細胞碎片；上清液通過0.22μm膜過濾后，4℃100,000g超離心70min；沉淀在預冷的PBS中重懸，4℃100,000g再離心70min，即得到樹突狀細胞來源的外泌體。