[發(fā)明專利]黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內(nèi)參基因及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210224009.5
• 申請日: 2022-03-07
• 公開（公告）號: CN115044693A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙俊茗;馬嘯;楊建;雷雄;董志曉
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都點睛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51232
• 代理人: 李玉興

1.黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內(nèi)參基因，其特征在于：所述內(nèi)參基因為Transcript-28482；所述Transcript-28482內(nèi)參基因的cDNA序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內(nèi)參基因在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理后基因表達分析中的應(yīng)用。

3.利用權(quán)利要求1所述的黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內(nèi)參基因在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理后基因表達分析方法，包括如下步驟：

1)材料培養(yǎng)與處理：選取黑藥仲彬草種子，經(jīng)1％次氯酸鈉消毒，無菌蒸餾水沖洗5遍后，將種子播于20×15×5cm塑料盆中，每盆1.5g，用石英砂覆蓋，澆注1/2倍的霍格蘭營養(yǎng)液，在晝夜溫度分別為23℃和19℃、光周期12h、相對濕度75％、光照強度250umol·m^-2·s^-1的生長室中培養(yǎng)21天后，將黑藥仲彬草植株分成三個處理組，將三個處理組的植株分別置于4℃的培養(yǎng)箱中進行冷脅迫、置于白天38/晚上33℃的培養(yǎng)箱中進行高溫處理以及用20％濃度的PEG-6000進行干旱脅迫，分別在每個處理開始后0小時、12小時、24小時、48小時和96小時采集葉片樣品，采集的樣品立即在液氮中冷凍，并儲存于-80℃的冰箱用于RNA的提取；

2)、黑藥仲彬草總RNA的提取：采用RNA提取試劑盒提取總RNA，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并使用NanoDrop對提取的RNA進行純度檢測以及濃度的定量；

3)、cDNA的合成：合格樣品采用Evo M-MLVRTMix試劑盒合成cDNA，儲存于-20℃?zhèn)溆茫籧DNA的合成的具體步驟如下：

首先，在PCR管中配制反應(yīng)液總量為20uL，反應(yīng)過程如下：先在37℃下反應(yīng)15min后，再85℃反應(yīng)5s，之后保持在4℃；所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系如表1所示:

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系

4)、目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的qRT-PCR反應(yīng)：

使用2×SYBR Green Pro Taq HS Premix進行qRT-PCR，將內(nèi)參基因和目標(biāo)基因點在同一塊PCR板上，反應(yīng)在CFX96^TM Real Time System熒光定量儀上進行，所述PCR反應(yīng)體系如表2所示：

表2 PCR反應(yīng)體系

擴增程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個循環(huán)，然后進行65～95℃溶解曲線分析，每個循環(huán)增加0.5℃，持續(xù)2-5s獲得解鏈溫度，采集溶解曲線熒光信號，Ct值數(shù)據(jù)由CFX96TM Real Time System熒光定量PCR儀自動讀取；

5)、將獲得的Ct值用2^-△△Ct法計算相對表達量,具體步驟如下：

△Ct＝Ct(目標(biāo)基因)-Ct(內(nèi)參基因)

△△Ct＝△Ct(處理)-△Ct(對照)

2^-△△Ct＝相對表達量。