[發明專利]黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因及其應用

在審

• 申請號: 202210224009.5
• 申請日: 2022-03-07
• 公開（公告）號: CN115044693A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 趙俊茗;馬嘯;楊建;雷雄;董志曉
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都點睛專利代理事務所(普通合伙) 51232
• 代理人: 李玉興

本發明公開了提供一種在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理下均能夠穩定表達的黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因。該內參基因比以往的其他物種上的通用內參基因具有特異性好,穩定性高等優點,同時該內參基因在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理條件下均具有穩定的表達水平，而現有的內參基因均無法實現在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理條件下均具有穩定的表達水平，因此，本發明所屬的內參基因比現有的通用內參基因具有更好的校正能力，填補了黑藥仲彬草研究領域中缺少合適的、通用的熒光定量PCR內參基因的空白,為今后黑藥仲彬草以及其他小麥族植物基因表達分析、篩選、驗證工作提供了有效的內參基因校正工具。適合在內參基因領域推廣運用。

技術領域

本發明屬于內參基因領域，具體涉及一種黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因及其應用。

背景技術

黑藥仲彬草(K.melanthera)屬禾本科(Poaeeae)小麥族(Triticeae)仲彬草屬(Kengyilia) 多年生異源六倍體自花授粉植物，主要分布于海拔3300-4750m的青藏高原干旱和半干旱的山坡、河谷、草原和草甸，對寒冷、干旱和鹽堿等不良環境具有高度的適應性，可用于高原荒漠化防治和生態恢復，其具有較高的飼用價值，也可作為高原牧草。此外，研究發現黑藥仲彬草對小麥赤霉病具有很強的抗性。這些優良特性，大都是麥類作物和牧草遺傳改良中需要改進的性狀，通過遠緣雜交、染色體工程、基因工程等現代遺傳和生物技術的方法將這些優良性狀的基因轉移到麥類作物和牧草的遺傳背景中是完全可能的。因此，作為麥類作物和牧草育種的重要基因資源，黑藥仲彬草具有重要意義。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)具有靈敏度高、特異性強、重復的動態定量范圍和高通量等優點，是植物科學領域中研究基因表達水平的常用技術之一。然而，在其分析過程中RNA 的質量和產量、反轉錄效率的差異以及其它阻礙因素等都會對目的基因表達分析結果的準確性產生影響。因此需要選擇合適的內參基因進行校正，從而減小檢測樣本之間的差異。理想的內參基因應該在各種條件下具有穩定的表達水平，例如不同組織、不同發育階段以及各種生物和非生物脅迫。在植物qRT-PCR分析中，常見的內參基因包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)、延伸因子-1a(EF-1α)、泛素(UBQ)、肌動蛋白(ACTIN)、α-微管蛋白(TUA)、β-微管蛋白(TUB)、18S rRNA和親環素(CYP)。而近年來的研究發現，這些常用內參基因在不同的環境條件、不同的發育階段和組織器官中表達并不是恒定不變的。同時，不同植物有最合適的內參基因，而同一種植物不同組織之間內參基因的穩定性也存在差異，只能在一定的試驗范圍內相對穩定。當選擇不適當的內參基因進行數據標準化時，往往會得到不正確的分析結果。因此，在特定實驗條件下為特定物種選擇表達穩定的內參基因對于目的基因表達水平分析至關重要。

然而，目前國內外尚無黑藥仲彬草內參基因的報道，嚴重制約了其優異抗性基因的挖掘與利用。本發明基于全長轉錄組數據開發在不同非生物脅迫(干旱、高溫和低溫)處理下黑藥仲彬草最穩定內參基因，并通過脅迫相關基因過氧化氫酶(CAT)進行了驗證。旨在找到黑藥仲彬草開展實時熒光定量PCR研究最穩定，最合適的內參基因，為今后探索和利用黑藥仲彬草抗性基因奠定基礎。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理下均能夠穩定表達的黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案為：該黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因，所述內參基因為Transcript-28482；所述Transcript-28482內參基因的cDNA序列如序列表 SEQUENCE ID NO.1所示。

本發明還發現了黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理后基因表達分析中的應用。

本發明還提供了利用所述黑藥仲彬草實時熒光定量PCR內參基因在黑藥仲彬草干旱、高溫和低溫處理后基因表達分析方法，包括如下步驟：