[發(fā)明專利]大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體及其構建方法

有效

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• 申請日: 2022-03-07
• 公開（公告）號: CN114525296B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設計）人: 費一諾;劉亞菲;耿文鑫;劉沛銘
• 申請（專利權）人: 常州藥物研究所有限公司
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N15/65;C12N15/64;C12R1/385
• 代理公司: 常州市權航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 趙慧

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種大腸桿菌?銅綠假單胞菌穿梭表達載體及其構建方法，其中大腸桿菌?銅綠假單胞菌穿梭表達載體包括：抗性篩選基因，復制蛋白基因和表達區(qū)片段；所述表達區(qū)片段包括：啟動子、RBS序列、多克隆位點、噬菌體λ的轉錄終止子Tsubgt;0/subgt;序列；所述啟動子（含RBS序列）及終止子Tsubgt;0/subgt;序列前后帶有酶切位點，可通過簡單的酶切、連接反應快速實現不同啟動子或終止子元件的更換，步驟簡單，極大地縮短了更換載體表達元件的時間，滿足多樣化、高通量的克隆需求。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體及其構建方法。

背景技術

鼠李糖脂(Rhamnolipids)是一類糖脂類的生物表面活性劑，其結構由親水基團和疏水基團兩部分構成，其中親水基團由1-2分子鼠李糖基組成，疏水基團由1-2個β-羥基脂肪酸單元組成。與傳統(tǒng)的化學表面活性劑相比，鼠李糖脂不但具有更優(yōu)異的表面活性和穩(wěn)定性，還具有無毒、無污染、能生物降解、生物相容性好、良好的抗菌活性和促進傷口愈合等優(yōu)點，從而在生物醫(yī)藥、食品、化妝品、農業(yè)、石油開采以及環(huán)境污染修復等眾多領域展示了其獨特的應用前景。隨著社會的發(fā)展和人們環(huán)保意識的增強，生物表面活性劑將有更加廣闊的前景，有望成為化學合成表面活性劑的替代品。

銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)體內含有合成鼠李糖脂的完整代謝途徑，也是目前用于合成鼠李糖脂最多的宿主。然而，目前鼠李糖脂的合成存在發(fā)酵產量低和分離成本高的問題，限制了它的工業(yè)化應用。大多數的研究，采用基因工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化(如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、過程控制等)兩種途徑提升鼠李糖脂產量。發(fā)酵工藝優(yōu)化雖然能夠顯著提升鼠李糖脂的產量，但轉化效率、發(fā)酵底物選擇、產物類型等重要生產指標仍受菌種遺傳的背景限制。因此，利用基因工程開發(fā)更高效的鼠李糖脂合成菌株受到了越來越多的關注。

在一定范圍內，細胞工廠產量與關鍵合成酶的表達量直接相關，通過基因表達層面的優(yōu)化提高合成酶的表達量是提高鼠李糖脂產量的一種有效策略。鼠李糖脂合成基因的過表達需要有載體的參與，但目前廣泛適用于大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體僅有pAK1900。大多數研究采用克隆完整的鼠李糖基轉移酶操縱子基因(rhlAB)，并將其連接到穿梭克隆載體的方法，實現基因的過表達。然而，該方法存在天然啟動子受到rhlR和rhlI等全局轉錄因子調控的問題，使得鼠李糖脂的產量提升并不理想。此外，Zhao等通過重疊延伸PCR技術將oprL基因的組成型啟動子與rhlAB基因連接，獲得pBBRPoprAB表達載體；Xie等利用Red/ET?DNA重組技術將3種不同強度的組成型啟動子(P_apra、P_tac和P_rhaB)替換rhlAB基因的原始啟動子，獲得相應的表達載體。上述兩種表達載體的構建方法步驟繁瑣，更換啟動子需要進行多次PCR，這不僅增加了PCR過程中引入突變的風險，也提高了克隆成本，降低了克隆的成功率，無法滿足多樣化、高通量的克隆需求。構建適用于銅綠假單胞菌的穿梭表達載體對于快速實現靶基因的過表達，提高鼠李糖脂的產量是至關重要的。

因此基于上述技術問題需要設計一種新的大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體及其構建方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體及其構建方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體，包括：

抗性篩選基因，復制蛋白基因和表達區(qū)片段；

所述表達區(qū)片段包括：啟動子、多克隆位點、噬菌體λ的轉錄終止子T₀序列；

所述啟動子及終止子T₀序列前后帶有酶切位點，以及

所述啟動子包括RBS序列。