[發明專利]一種復發肺癌穿刺樣本類器官培養基及其應用

在審

• 申請號: 202210207476.7
• 申請日: 2022-03-03
• 公開（公告）號: CN114480287A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 宋偉;柏衛華
• 申請（專利權）人: 宋偉;柏衛華
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 上海和華啟核知識產權代理有限公司 31339
• 代理人: 余昌昊

1.一種復發肺癌細胞類器官培養基，其特征在于，所述培養基包含如下組分：DMEM/F12K/1640培養基1:1:1-2，抗壞血酸1-100mg/L，L-谷氨酸1-100mg/L，亞硒酸鈉0.002-0.5mg/L，乙醇胺鹽酸鹽2-200mg/L，偏釩酸銨1×10^-4-20×10^-4mg/L，四水合氯化錳5×10^-5-50×10^-5mg/L，R-spondin1 50-1000ng/ml，Noggin10-200ng/ml，N2:B27(0.1×-2×)，谷氨酰胺補劑(1×)，HEPES(1×)，煙酰胺1-100mM，Normocin^TM(1×)，N-乙酰半胱氨酸0.1-10mM，Wnt3a10-500ng/ml。

2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述培養基還包括以下物質的一種或多種：A83-01、EGF，Gastrin I。

3.根據權利要求2所述的培養基，其特征在于，所述A83-01濃度為0.1-50μM；所述EGF濃度為10-200ng/ml；所述Gastrin I濃度為5-25nM。

4.根據前述任一權利要求所述的培養基，其特征在于所述培養基中還包括下述物質的一種或多種的組合：肝素，FGF2，HGF，優選的，所述肝素的濃度為1-200IU/ml，所述FGF2濃度為1-100ng/ml；所述HGF濃度為5-500ng/ml。

5.根據前述任一權利要求所述的培養基，其特征在于所述培養基中還包括CHIR99021，優選的，所述CHIR99021濃度為1-20μM，和/或，所述培養基中還包括DMSO，優選的，所述二甲亞砜濃度為培養基體積比的0.01-2％。

6.一種利用上述任一權利要求所述培養基培養復發肺癌細胞類器官的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1).取復發肺癌穿刺樣本，4℃保存于專用保存液中，24小時內低溫轉移至操作室；

2).樣本低溫破碎，酶解消化；

3).低溫離心去除上清，冰PBS重懸，此過程重復3-5次；

4).低溫離心去除上清，依據獲得細胞情況，1-5ml冰PBS重懸后顯微鏡下計數細胞；

5).低溫離心去除上清，依據細胞計數加入適量冰Matrigel重懸接種于24孔板，加入肺癌培養液，每3天更換一次相應培養液；

6).腫瘤類器官培養6-12天后，每孔添加1ml冰PBS，反復吹打，移入15ml離心管；

7).低溫離心去除上清，冰PBS重懸，此步驟重復3-5次，直至Matrigel全部清除；

8).離心結束后，冰Matrigel重懸，1:3接種擴增；

9).待腫瘤類器官穩定傳代后，重復步驟8，一半類器官做藥物敏感性實驗，一半類器官用細胞凍存液凍存。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)消化使用的是膠原蛋白酶。

8.根據權利要求6-7任一項所述的方法，低溫離心去除上清的操作中，溫度為4℃，離心轉速為70-300g。

9.權利要求1-5任一所述培養基或權利要求6-8任一項所述的方法在制備復發性肺癌類器官模型中的應用。

10.由前述任一權利要求獲得的類器官模型在篩選靶向復發性肺癌藥物中的應用。