[發明專利]一種亞細胞區室化生產衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌及應用

在審

• 申請號: 202210206191.1
• 申請日: 2022-03-02
• 公開（公告）號: CN114561309A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 于愛群;榮蘭新;盧志慧;王亞平;肖冬光;張翠英
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/60;C12N15/62;C12N15/81;C12P7/44;C12R1/645
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種區室化生產衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌構建及應用。所述基因工程菌以解脂耶氏酵母為出發菌株，將順?烏頭酸脫羧酶編碼基因通過增強型過氧化物酶體定位信號ePTS1在過氧化物酶體中進行定位表達獲得。通過引入ePTS1將衣康酸在過氧化物酶體中進行區室化表達后，衣康酸產量有明顯提升，提高了47倍左右；采用廚房廢油(YPO)為培養基，衣康酸產量提高了108倍左右。可見，定位改造后的基因工程菌株，更適合工業應用，可降低生產成本，提高生產效率；而采用廚房廢油作為培養基不僅實現廢物利用，降低成本，而且產量遠遠高于常用普通培養基。

技術領域：

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種區室化生產衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌構建及應用。

背景技術：

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種非常規的產油酵母，由于其充足的前體供應，適于生產各種源于乙酰輔酶A的下游化合物。但以葡萄糖為碳源時，產生乙酰輔酶A的同時會伴隨二氧化碳(CO₂)的釋放，造成碳損失及得率的降低。而以脂肪酸作為底物時，脂肪酸轉化成酰基輔酶A后進入過氧化物酶體，經過β-氧化產生乙酰輔酶A，這一過程不產生CO₂，不存在碳源的損失，具有更高的碳轉化率。近年來越來越多的研究表明，特定酶或者代謝途徑的亞細胞定位不僅有助于提高產物轉化效率，而且能夠起到消除競爭性代謝抑制的作用。

區室化工程是利用細胞中細胞器獨特的生理生化功能進行代謝工程與合成生物學研究等。同時，由于細胞器膜的阻隔，代謝途徑的細胞器或者亞細胞定位能夠避免胞質環境的代謝競爭，提高產物合成效率。細胞器有許多獨特的生理和代謝環境，比如內質網與脂質的形成有關，過氧化物酶體參與脂肪酸的β-氧化且具有較高的蛋白質濃度，細胞核富含DNA等等。

衣康酸(C₅H₆O₄)學名為甲叉琥珀酸，亞甲基丁二酸，是一種不飽和二元有機酸。它含有不飽和雙鍵，具有活潑的化學性質，可進行自身間的聚合，也能與其他單體如丙烯腈等聚合，微溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚、二硫化碳，溶于水、乙醇、丙酮；能進行各種加成反應，酯化反應和聚合反應，是化學合成工業的重要原料，也是化工生產的重要原料。其在酸性、中性和中等堿性條件下均表現為性質穩定，可用于樹脂、纖維、洗滌劑、清潔劑和生物活性成分等工業產品的合成。衣康酸的工業生產有化學合成和生物合成兩種方式，化學合成主要是利用化工方法從石油化工產品中制備，然而這種方法存在原料利用率低、產品不易分離純化的問題，使其在大規模工業化生產中受到了限制。衣康酸的生物合成方法是指通過對微生物代謝途徑的遺傳修飾來完成目標產物的制備。其中，土曲霉、玉米黑粉菌、念珠菌屬、畢赤酵母等真菌天然生產衣康酸的能力較強。然而，真菌具有菌絲表型，這是因為它們對剪切應力的耐受性較差。高度分支的菌絲絲在發酵過程中產生高的肉湯粘度，這給常規攪拌槽發酵罐中的混合和通氣過程帶來了重大挑戰。此外，它們發酵需要添加堿以維持中性pH條件，這也增加了培養期間細菌污染的可能性。解脂耶氏酵母本身并不能產生衣康酸，但它對衣康酸具有較高的耐受性。因此近年來，利用代謝工程及合成生物學改造解脂耶氏酵母異源生產衣康酸成為了相關研究的熱點。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題就是解決在解脂耶氏酵母中異源合成衣康酸產量低的問題，提供一株導入順-烏頭酸脫羧酶(CAD)基因的解脂耶氏酵母基因工程菌以及該菌株在異源合成衣康酸中的用途，其能夠合成衣康酸并通過代謝工程或合成生物學手段提高衣康酸產量。

本發明提供的技術方案之一：是一種解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母為出發菌株，通過導入順-烏頭酸脫羧酶編碼基因來獲得。

所述順-烏頭酸脫羧酶編碼基因，其核苷酸如序列表SEQ ID NO.1所示；是通過土曲霉HAT418的基因組上兩段不含內含子的基因片段進行融合獲得的。

進一步地，所述CAD基因是通過質粒在宿主細胞中表達；

更進一步地，所述質粒為pYLEX1；