[發(fā)明專(zhuān)利]一種樹(shù)鼩睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210205986.0
• 申請(qǐng)日: 2022-03-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114717178A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 代解杰;鄧偉;罕園園;王文廣;陸彩霞;李娜;孫曉梅;仝品芬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/071
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/071;G01N33/543;C12Q1/02;A61P15/08;A61K35/52
• 代理公司: 昆明正原專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 亢能;陳左

1.一種樹(shù)鼩睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：按以下步驟進(jìn)行：

步驟一：分離；

取出睪丸實(shí)質(zhì)組織，清洗后將其剪碎后轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)；加入1mg/mLIV膠原酶，放入CO₂培養(yǎng)箱孵育30~35min，離心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打混勻，將細(xì)胞懸液放入細(xì)胞篩網(wǎng)中過(guò)濾，使之分散成單個(gè)細(xì)胞；收集到離心管中，離心，棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，重復(fù)離心一次；

步驟二：純化；

采用percoll密度梯度離心法：將分離得到的細(xì)胞懸液加于不同密度梯度的Percoll分離液上，從分離管底部向上密度依次為60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min離心30min；

收集37%和60%之間的細(xì)胞，后用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋?zhuān)賹乙阂?500r/min離心10min，沉淀加入含胎牛血清的培養(yǎng)液，搖勻得細(xì)胞懸液；將分離純化得到的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，后稀釋成1×10⁶個(gè)/m L濃度的細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為DMEM/F12培養(yǎng)基加10%FBS、1%青-鏈霉素；

此時(shí)細(xì)胞中還含有少量支持細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，根據(jù)間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，在傳代后6h更換培養(yǎng)液以去除雜細(xì)胞達(dá)到純化目的，第2代和第3代的細(xì)胞仍按此步驟進(jìn)一步純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：分離之前還進(jìn)行以下操作：

取3月齡的雄性樹(shù)鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥鈉麻醉處死后，無(wú)菌取出睪丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS沖洗兩遍去乙醇；移入Heraguard ECO 超凈工作臺(tái)，去除睪丸的白膜、附睪及血管，小心取出睪丸實(shí)質(zhì)組織，置于裝有預(yù)冷D-Hanks液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，洗滌2遍，去除血跡。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在percoll密度梯度離心純化的基礎(chǔ)上，根據(jù)支持細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的貼壁速度不同，通過(guò)差異貼壁的方法，在原代細(xì)胞貼壁6~12h換液，此方法操作至第3代可得到純度高達(dá)98%的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，并能夠快速增殖，具備基礎(chǔ)的睪酮分泌能力。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟一中，加入1mg/mLIV膠原酶，放入37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱孵育30~35min，1000r/min離心5min，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打混勻，將細(xì)胞懸液放入40目細(xì)胞篩網(wǎng)中過(guò)濾，使之分散成單個(gè)細(xì)胞；收集到15mL離心管中，1000r/min離心5min，棄上清。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟二中，從分離管底部向上密度依次為60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min離心30min；收集37%和60%之間的細(xì)胞，后用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋?zhuān)賹乙阂?500r/min離心10min，沉淀加入含胎牛血清的培養(yǎng)液，搖勻得細(xì)胞懸液；將分離純化得到的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，后稀釋成1×106個(gè)/m L濃度的細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為DMEM/F12培養(yǎng)基加10%FBS、1%青-鏈霉素。

6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法制備的物質(zhì)在制備治療Zikv感染導(dǎo)致的雄性睪丸損傷及不育的藥物中的應(yīng)用。

7.一種治療Zikv感染導(dǎo)致的雄性睪丸損傷及不育的藥物，其特征在于：包括權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法制備的物質(zhì)。