[發明專利]一種樹鼩睪丸間質細胞的分離培養方法及其應用

在審

• 申請號: 202210205986.0
• 申請日: 2022-03-03
• 公開（公告）號: CN114717178A
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 代解杰;鄧偉;罕園園;王文廣;陸彩霞;李娜;孫曉梅;仝品芬
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;G01N33/543;C12Q1/02;A61P15/08;A61K35/52
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 亢能;陳左

本發明涉及一種樹鼩睪丸間質細胞的分離培養方法及其應用，該方法包括分離、純化。本發明成功建立樹鼩睪丸間質細胞的分離培養方法，確定了寨卡病毒（Zika virus，Zikv）對樹鼩睪丸間質細胞的易感性和病毒增殖特性，為Zikv入侵生殖系統機制研究提供基礎。

技術領域

本發明涉及細胞培養及應用領域，尤其是一種樹鼩睪丸間質細胞的分離培養方法及其應用。

背景技術

寨卡病毒（Zika virus, Zikv）為單股正鏈RNA病毒,主要通過病毒感染的伊蚊類蚊媒叮咬傳播,寨卡病毒能夠靶向感染神經前體細胞，抑制神經干細胞增殖并引起其分化異常，并最終導致大腦皮層變薄、腦腔體積變大，出現小頭癥表現。此外，研究表明將寨卡病毒感染可導致小鼠睪丸發生炎癥。嚴重時會引起睪丸內部結構受損及細胞大量死亡，對男性生殖健康帶來潛在威脅，但其相關感染機制尚不明確。

睪丸間質細胞（Leydig cells，LCs）主要分布于生精小管之間，是睪丸主要細胞類型之一。LCs在毒理學、藥理學及生殖遺傳學等研究方面具有十分重要的應用意義，其功能主要是分泌睪酮，是睪丸中唯一能夠分泌睪酮的細胞，可促進精子的發生和男性生殖器官發育，以及維持第二性征和性功能，大約95%的雄激素由其分泌，在生殖上具有不可替代的作用，研究發現LCs數量缺少會導致雄性激素缺乏，從而引起生殖上的問題，體外分離培養純度高、活性強的LCs可更好的研究其相關機制和特性。

目前對LCs分離培養主要集中在大小鼠、牛羊等哺乳動物上，但對于新型實驗動物樹鼩的LCs分離培養鮮有報道。樹鼩（Tree shrew，tupaia belangeri）在生理、生化、新陳代謝、解剖結構以及基因組等生物學特性比嚙齒類更接近于非人靈長類，且由于體型小、繁殖快等特點，且對許多人類病毒易感而導致疾病，已廣泛應用于人類疾病模型的研究，包括病毒感染模型、腫瘤模型、呼吸系統疾病模型和神經系統疾病模型等。

睪丸中主要有生精細胞、支持細胞和間質細胞等，其中LCs占睪丸細胞的2%~4%，數量較少且純化難度較大，因此找到一種合適的分離純化方法至關重要。目前對于睪丸間質細胞的分離培養主要有機械分離法、組織塊貼壁法、酶消化法、percoll密度梯度離心法等幾種方法，機械分離法對細胞損傷較大，組織塊貼壁法雜細胞太多且周期較長，percoll密度梯度離心法得到的細胞仍存在其他雜細胞，還需要添加各種營養成分和生長因子。

如何提高分離效率，通過Zikv對LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睪丸細胞模型，為研究Zikv感染雄性生殖系統的相關研究提供實驗基礎，是值得研究的。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提出一種樹鼩睪丸間質細胞的分離培養方法及其應用。

本發明是在對其他動物LCs培養與純化方法的基礎上，采用酶消化、percoll密度梯度離心及差異貼壁等分離純化方式結合，建立樹鼩LCs原代培養和純化的高效、簡單方法，為利用樹鼩開展相關研究提供新的實驗材料；通過Zikv對LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睪丸細胞模型，為研究Zikv感染雄性生殖系統的相關研究提供實驗基礎。

本發明的技術方案具體如下：

一種樹鼩睪丸間質細胞的分離培養方法，按以下步驟進行：

步驟一：分離；

取出睪丸實質組織，清洗后將其剪碎后轉入離心管內；加入1mg/mLIV膠原酶，放入CO₂培養箱孵育30~35min，離心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培養基終止消化，吸管吹打混勻，將細胞懸液放入細胞篩網中過濾，使之分散成單個細胞；收集到離心管中，離心，棄上清，加入DMEM/F12培養液重懸細胞，重復離心一次；

步驟二：純化；