[發明專利]一種基于平衡補償的重組流感病毒構建方法

有效

• 申請號: 202210201573.5
• 申請日: 2022-03-03
• 公開（公告）號: CN114574521B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 杜瑞坤;崔清華;榮立軍;趙秀娟
• 申請（專利權）人: 山東中醫藥大學;山東中醫藥大學青島中醫藥科學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/53;C12N7/01;A61K49/00;C12R1/93;A61K39/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 趙穎

本發明公開了一種基于平衡補償的重組流感病毒構建方法。所述方法基于平衡補償的原則，在插入外源基因的目標節段引入補償性突變，所述補償性突變能夠重新實現重組病毒基因組多節段的微平衡，減少或消除病毒衰減機制，產生具備遺傳穩定性的重組流感病毒。

技術領域

本發明涉及流感病毒反向遺傳學技術，尤其涉及一種基于平衡補償的重組流感病毒構建方法。

背景技術

近年來，反向遺傳學的快速發展促進了攜帶多種報告基因且具有復制能力的重組甲型流感病毒(Influenza?A?virus,IAV)的產生，這些流感報告病毒能夠實現病毒復制的快速量化。此外，基于流感報告病毒還能夠建立病毒感染小動物活體成像模型，該模型對于新型抗病毒藥物的開發具有重要意義。這些IAV感染的活體成像動物模型對新型抗病毒藥物的開發產生深遠的影響。

然而，由于IAV基因組的分節段結構限制了其對外來基因插入的耐受性，這些流感報告病毒在細胞或動物體內復制過程中，容易呈現復制能力降低、毒力下降或基因組不穩定等現象。因此，當前流感報告病毒構建大多選擇較小的報告基因。

一系列定向進化策略能夠為報告IAV提供優化。例如，Katsura?et?al.和Cai?etal.利用報告IAV在小鼠中進行連續傳代和定向篩選，最終產生的小鼠適應性突變株其毒力與野生型相近，且報告基因表達水平顯著提高。測序分析顯示，在這兩種情況下，相關突變均發生于RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，盡管其精確的突變位點有所不同[Katsura?H,etal.Amino?acid?changes?in?PB2?and?HA?affect?the?growth?of?a?recombinantinfluenza?virus?expressing?a?fluorescent?reporter?protein.Sci?Rep.2016Feb?5；6:19933.Cai?H,et?al.Directed?Evolution?of?an?Influenza?Reporter?Virus?ToRestore?Replication?and?Virulence?and?Enhance?Noninvasive?BioluminescenceImaging?in?Mice.J?Virol.2018Jul?31；92(16):e00593-18.]。然而，考慮到這種定向進化策略極為耗時，且無法保證最終效果，開發一種普遍適用的重組流感病毒構建策略具有重要意義。

甲型流感病毒的基因組包含8段單股負鏈病毒RNA片段。根據各個片段負責編碼的主要病毒蛋白，它們分別被命名為PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS。在病毒復制的過程中，這8條病毒RNA(vRNA)分別與多個單位的NP蛋白以及一組PA、PB1和PB2構成的RdRp(RNAdependent?RNA?polymerase)復合體行成vRNP，最終以vRNP(viral?ribonucleoprotein)的形式包裝進入病毒體。盡管這些病毒RNA片段的長度從2341至891核苷酸不等，但它們都具有相似的遺傳結構，節段中間為中心編碼區，兩端各有一段非編碼區(NCR)。同時vRNA的5'端前13個核苷酸(nts)和3'端前12個nts相互作用部分互補形成病毒RdRp復合物的啟動子結構。流感聚合酶復合物和啟動子結構的構象是可變的，通過相互作用動態地調節病毒轉錄和復制。此外，病毒基因組多節段需要結合病毒聚合酶進行復制和轉錄，這一過程中病毒基因組多節段存在相互競爭。例如，當RdRp復合物不足時，一個節段vRNA的復制/轉錄會受到其他七個對應片段存在的負面影響，而隨著聚合酶存量趨于飽和時，這種競爭可以得到緩解。