[發(fā)明專利]一種牛紐布病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物、探針及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210199698.9
• 申請(qǐng)日: 2022-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN114703321A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周偉光;趙潤(rùn)濤;張志丹;悉尼尼根;王旭芬;侯琳;張賀;趙洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種牛紐布病毒TaqMan熒光定量RT?PCR檢測(cè)引物、探針及應(yīng)用。屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。包括：引物NB?F?4716、NB?R?4949和探針NBV?TZ。本發(fā)明最佳上下游引物濃度均為500nmol/L，探針濃度為400nmol/L，在1×10⁸～1×10¹copies/μL之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R²＝0.996，擴(kuò)增效率為105.9％；特異性較強(qiáng)，敏感性較高，對(duì)BNeV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)下限為1×10¹copies/μL，重復(fù)性較好，組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于3％；為BNeV的檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種牛紐布病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物、探針及應(yīng)用。

背景技術(shù)

紐布病毒(Nebovirus，NeV)是杯狀病毒科、紐布病毒屬的唯一成員，同科的病毒還有諾如病毒屬(Norovirus)、札幌病毒屬(Sapovirus)、水皰疹病毒屬(Vesivirus)、兔病毒屬(Lagovirus)。

NeV為無(wú)囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約為7.4kb，由兩個(gè)開放的閱讀框(ORFs)組成，分為三種基因型：NB、NA1和DijonA216。紐布病毒的易感動(dòng)物只有牛，可誘發(fā)犢牛厭食癥和木糖吸收不良，盡管目前尚無(wú)NeV的分離培養(yǎng)體系，但在排除了其他病毒的含NeV腹瀉糞便無(wú)菌處理后感染新生無(wú)菌小牛，可引起嚴(yán)重腹瀉和腸道損傷，尤其在十二指腸和空腸最為嚴(yán)重。

目前已在美國(guó)、英國(guó)、巴西以及我國(guó)犢牛糞樣檢測(cè)出了BNeV，其分子生物學(xué)檢測(cè)方法有SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法、TB Green熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，巢氏RT-PCR檢測(cè)方法、常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法，尚未見TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)牛紐布病毒的報(bào)道。

因此，如何提供一種牛紐布病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法、體系，提供更為準(zhǔn)確的結(jié)果是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種牛紐布病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物、探針及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種牛紐布病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物，包括：引物NB-F-4716，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；引物NB-R-4949，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選的：還包括探針NBV-TZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還提供了含有上述引物的試劑或試劑盒。

本發(fā)明還提供了一種非診斷治療目的使用TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)牛紐布病毒的方法，使用上述的引物。

優(yōu)選的包括擴(kuò)增體系：GoTaq Probe qPCRMaster Mix 10μL，ScriptTMRT-MIX for1-Step RT-qPCR 2×0.4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，10μmol/L探針0.8μL，cDNA模板2μL，余量RNase-Free ddH2O，總體積為20μL。

優(yōu)選的：包括擴(kuò)增程序：45℃反轉(zhuǎn)錄15min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45個(gè)循環(huán)。