[發明專利]一種原位檢測分離酶裂解產物的方法

有效

• 申請號: 202210194125.7
• 申請日: 2022-03-01
• 公開（公告）號: CN114456266B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 亞歷山大·斯特輪尼科夫·弗拉基米羅維;梁杰榮;劉劍;吳瓊芳;阿卜杜拉林·布卡巴
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;C12Q1/6804;C12Q1/6869;G01N33/577
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 王艷齋

本發明提供了一種原位檢測分離酶裂解產物的方法，包括使用抗REC8新表位單克隆抗體和/或抗RAD21新表位單克隆抗體，識別內聚蛋白水解后產生的新表位，再配合ChIP?seq分析，構建染色質蛋白裂解圖譜，對分離酶裂解產物進行原位檢測。本發明還提供了一種抗REC8新表位單克隆抗體和一種抗RAD21新表位單克隆抗體。上述兩種內聚蛋白新表位單克隆抗體具有良好的特異性，為染色質蛋白裂解圖譜的構建以及分離酶裂解產物的原位檢測創造了條件。

技術領域

本發明屬于表觀遺傳學技術領域，尤其涉及一種原位檢測分離酶裂解產物的方法。

背景技術

內聚蛋白復合物是一種多功能蛋白聚合物，在體細胞中既可在分裂間期組織基因表達，同時又在細胞有絲分裂周期的特定時間維持和釋放姐妹染色單體內聚，發揮著關鍵作用。然而，在配子發育過程中，哺乳動物種系細胞中同時存在多種不同的內聚蛋白復合物，目前實驗研究已經對至少兩種內聚蛋白復合物進行了詳細的特征研究：基于REC8和RAD21L的復合物(Biswas，2016)。雖然RAD21L在低等真核生物中不存在，但REC8是普遍存在的減數分裂內聚蛋白亞基，同時在減數分裂的染色體和染色單體分離中發揮關鍵作用。

減數分裂的基因表達程序和細胞調控極其復雜，涉及多個相互獨立的調控因子。減數分裂內聚蛋白復合物REC8/SMC1B/SMC3/STAG3和RAD21L/SMC1B/SMC3/STAG3對于減數分裂的基因重組和染色體分離是必不可少的，而體細胞內聚蛋白復合物RAD21/SMC1A/SMC3/SA1orSA2在減數分裂中發揮的作用較小。在第一次減數分裂期間，分離酶對減數分裂內聚蛋白REC8的位點特異性剪切是真核生物產生配子的關鍵步驟，但目前，這一關鍵裂解步驟的染色體定位和動態分析只能基于較低等真核生物的下游遺傳數據中大概推斷。

內聚蛋白復合物是有絲分裂和減數分裂中染色體分離所必需的。減數分裂內聚蛋白亞基在癌癥中經常以癌睪丸(CT)基因的形式表達，并與腫瘤的發生具有潛在的相關性。染色質內聚蛋白的移除依賴于分離酶的裂解，這一蛋白水解作用是人類生育的重要過程，也可能與某些癌癥的發生初期具有相關性，非計劃性的分裂和分裂阻滯都不利于物種的遺傳內穩態。因此，準確研究出這一通路的作用機制及功能對于人類健康發展具有重要的意義。

發明內容

針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種原位檢測分離酶裂解產物的方法，其可以在原生未受干擾的細胞中繪制特定的染色質蛋白的裂解圖譜。該方法以一種特異性單克隆抗體為中心，設計用于識別體內特定蛋白水解產生的多肽(例如新表位)的COOH末端，并結合ChIP-seq分析，即可構建染色質蛋白的裂解圖譜。既適用于非人類的靈長類動物，也適用于人類細胞，而且還可以被開發應用于其他物種。

為達此目的，本發明采用如下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種原位檢測分離酶裂解產物的方法，所述原位檢測分離酶裂解產物的方法包括：

使用抗REC8新表位單克隆抗體和/或抗RAD21新表位單克隆抗體，識別內聚蛋白水解后產生的新表位，再配合ChIP-seq分析，構建染色質蛋白裂解圖譜，對分離酶裂解產物進行原位檢測。

本發明中，所述原位檢測分離酶裂解產物的方法通過使用可以分別識別兩種內聚蛋白水解后產生的新表位的單克隆抗體，從而確定水解過程中具體的蛋白斷裂位點，再結合ChIP-seq分析等手段，構建了染色質蛋白裂解圖譜，為相關的研究創造了條件。

優選地，所述的抗REC8新表位單克隆抗體識別REC8蛋白水解后產生的新表位；

所述抗REC8新表位單克隆抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括SEQ ID No.1所示的CDR3。

優選地，所述重鏈可變區包括SEQ ID No.2所示的CDR2。

優選地，所述重鏈可變區包括SEQ ID No.3所示的CDR1。