[發明專利]一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202210190373.4
• 申請日: 2022-02-28
• 公開（公告）號: CN114774514A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 婁加陶;王琳;郭志偉;余佳佳;楊國華
• 申請（專利權）人: 上海羿鳴生物科技有限公司;羿鳴（蘇州）診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

本發明涉及一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法，步驟包括：將片段化DNA中非甲基化的C堿基轉化為U堿基；通過若干線性擴增引物對包括靶向區域的步驟S1轉化后的片段化DNA進行線性擴增；在步驟S2線性擴增后的產物中加入連接酶以及接頭；對步驟S3連接后的產物進行PCR擴增，即得DNA測序文庫分子；所述線性擴增所采用的酶組合物包括：至少一種具有3’?5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶和/或至少一種不具有3’?5’外切酶活性的DNA聚合酶。本發明的文庫構建方法通過在高保真DNA聚合酶中添加其他類型的DNA聚合酶，以有效提高線形擴增效率，并提升文庫轉化效率，最終達到有效檢測稀有的甲基化DNA分子(占比0.3％)。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法及其試劑盒。

背景技術

DNA甲基化的特征是在DNA甲基轉移酶(DNMT)的作用下，胞嘧啶中嘧啶環第5位碳原子上添加上甲基基團(-CH₃)，并且甲基的共價加成通常發生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶中。DNA甲基化能夠引起染色質結構、DNA穩定性等發生改變，從而控制機體基因的表達。基因組DNA的異常甲基化與癌癥、衰老、老年癡呆等多種疾病密切相關，是表觀遺傳學的重要研究內容之一。

近年來，甲基化的高通量檢測技術不斷更新迭代，基于下一代測序技術(NGS)的高通量測序方法具有準確，靈敏度高，通量大等優勢，已經成為研究甲基化標志物的主流高通量檢測技術。DNA經亞硫酸氫鹽處理后，其胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶殘基，5-甲基胞嘧啶(5mC)則保持不變。轉化后的DNA通過特定探針捕獲或特定引物PCR，對目標區域進行靶向檢測。亞硫酸氫鹽檢測法可以達到單堿基精度，是當前的主流技術手段。

目前，基于亞硫酸鹽轉化的NGS高通量甲基化檢測方法的主要策略是直接對亞硫酸鹽處理后變性的DNA單鏈分子進行連接建庫的方式，來完成文庫構建。由于亞硫酸鹽處理后的單鏈分子無法同時在兩端連接上接頭，都需要先連接一側接頭，然后再連接第二接頭，至少兩步連接才能完成單鏈分子的文庫構建。而文庫后續的靶向捕獲與NGS測序和前一種策略類似。此類技術由于需要對單鏈分子進行兩次連接建庫，大幅提升了建庫的復雜性，而多次連接也會大幅降低文庫分子的建庫轉化效率，導致針對單鏈分子的建庫轉化效率不足10％，難以滿足對于稀有甲基化分子的檢測。

同時，在后續的研究中發現，單一的高保真DNA聚合酶對于亞硫酸鹽處理后的DNA線形擴增效率較低，難以檢測稀有的甲基化分子，特別是當甲基化分子占比低于1％時。因此，亟需一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法及其試劑盒。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，通過在高保真DNA聚合酶中添加其他類型的DNA聚合酶，以有效提高線形擴增效率，并提升文庫轉化效率，最終達到有效檢測稀有的甲基化DNA分子(占比0.3％)。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

本發明的第一方面是提供一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法，步驟包括：

S1、將片段化DNA中非甲基化的C堿基轉化為U堿基；

S2、通過若干線性擴增引物對包括靶向區域的步驟S1轉化后的片段化DNA進行線性擴增；

S3、在步驟S2線性擴增后的產物中加入連接酶以及接頭；

S4、對步驟S3連接后的產物進行PCR擴增，即得DNA測序文庫分子；

其中，所述線性擴增引物包括：第一通用序列和特異性靶向序列，所述線性擴增所采用的酶組合物包括：至少一種具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶和/或至少一種不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；所述接頭包括：第二通用序列；所述PCR擴增所采用的引物特異性結合所述第一通用序列以及所述第二通用序列。