[發明專利]一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202210190373.4
• 申請日: 2022-02-28
• 公開（公告）號: CN114774514A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 婁加陶;王琳;郭志偉;余佳佳;楊國華
• 申請（專利權）人: 上海羿鳴生物科技有限公司;羿鳴（蘇州）診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

1.一種適用于高通量靶向基因組甲基化檢測的文庫構建方法，其特征在于，步驟包括：

S1、將片段化DNA中非甲基化的C堿基轉化為U堿基；

S2、通過若干線性擴增引物對包括靶向區域的步驟S1轉化后的片段化DNA進行線性擴增；

S3、在步驟S2線性擴增后的產物中加入連接酶以及接頭；

S4、對步驟S3連接后的產物進行PCR擴增，即得DNA測序文庫分子；

其中，所述線性擴增引物包括：第一通用序列和特異性靶向序列，所述線性擴增所采用的酶組合物包括：至少一種具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶和/或至少一種不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；所述接頭包括：第二通用序列；所述PCR擴增所采用的引物特異性結合所述第一通用序列以及所述第二通用序列。

2.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述將片段化DNA中非甲基化的C堿基轉化為U堿基的方法包括：亞硫酸氫鹽轉化法或酶轉化法。

3.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述線性擴增引物如SEQ IDNO.11-20中的至少一種所示。

4.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述至少一種具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶包括：Apo-Enchant Polymerase I、Platinum^TMSuperFi^TM DNAPolymerase、KOD One^TM PCR Master Mix或KOD-MuLtiEpi-^TM中的至少一種。

5.根據權利要求4所述的文庫構建方法，其特征在于，所述至少一種具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶包括：Apo-Enchant Polymerase I和/或KOD-MuLtiEpi-^TM。

6.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述至少一種不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶包括：rTth DNA Polymerase或rTaq DNA Polymerase中的至少一種。

7.根據權利要求6所述的文庫構建方法，其特征在于，所述至少一種不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶包括：rTth DNA Polymerase。

8.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于，所述線性擴增所采用的酶組合物包括：Apo-Enchant Polymerase I和rTth DNA Polymerase。

9.根據權利要求7所述的文庫構建方法，其特征在于，所述線性擴增所采用的酶組合物包括：Apo-Enchant Polymerase I、KOD-MuLtiEpi-^TM和rTth DNA Polymerase。

10.一種適用于如權利要求1-9任一項所述文庫構建方法的試劑盒，其特征在于，包括：線性擴增引物、線性擴增酶組合物、連接酶、接頭以及PCR擴增引物。