[發明專利]一種多能干細胞的傳代方法

有效

• 申請號: 202210190050.5
• 申請日: 2022-02-28
• 公開（公告）號: CN114807018B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 宋蕓娟;蔣斌;溫斌
• 申請（專利權）人: 深圳市曠逸生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/074;B26D1/00;B26D7/26
• 代理公司: 深圳市合道英聯專利事務所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果

本發明公開了一種多能干細胞的傳代方法該方法包括傳代工具和配制的解離液；傳代工具包括精密彈簧，滾軸，鑷子，且精密彈簧套設在滾軸上，滾軸表面設有卡槽可以被固定在鑷子尖端通過壓縮彈簧調節彈簧絲間距，將組件滅菌后可以用于多能干細胞傳代，傳代時握住鑷子推滾精密彈簧，利用精密彈簧絲切割多能干細胞集落，將其切割成大小均勻的小片，然后添加解離液使切割后的多能干細胞片容易被移液洗脫收集，進而完成多能干細胞的傳代擴增。本發明方法簡單可靠，通用易行，成本低廉，整合了已有方法的各種優點，并且無需酶和鈣離子螯合劑消化，不會破壞多能干細胞的細胞外基質，可以高效的進行多能干細胞傳代。

技術領域

本發明屬于干細胞傳代的技術領域，具體涉及一種多能干細胞的傳代方法。

背景技術

多能干細胞具有自我更新和保持多向分化的能力，是藥物篩選和組織器官再生和醫療的基礎，具有巨大的應用價值；多能干細胞通常貼壁生長在小鼠飼養層細胞或者特殊膠質包被的培養皿上，鋪展形成典型的圓形，多邊形集落；在集落接近融合的時候，需要對多能干細胞進行傳代擴增；通常所用的擴增方式是是采用酶消化，例如IV型膠原酶，dispase等，處理時間5-10分鐘，待多能干細胞集落邊緣略微卷起時移除消化酶加入一定量的培養基清洗后使用移液槍或移液管吹吸培養基，將多能干細胞集落吹散打小為10-30個干細胞的團塊，移入到新的培養皿中擴增生長；通過吹打形成的多能干細胞團塊不能有效控制團塊的大小，吹打過大容易造成次代多能干細胞發生自發分化，吹打過小易于造成多能干細胞傳代后凋亡，并且大小不一的團塊使得多能干細胞生長無法同步化，不能均質的滿足分化和藥物需要；可以形成有效控制傳代時多能干細胞團塊大小是多能干細胞研究和應用的關鍵技術之一。

目前美國Invitrogen公司提供一款專門用于多能干細胞傳代的工具StemProEZPassage，其利用特殊制備的滾輪可以將多能干細胞集落垂直交叉切割成大小均勻的小片，再通過移液管吹打，將多能干細胞小片收集后按一定比例轉入新的培養皿中進行擴增培養。這款產品的制備對設備材料以及工藝的要求極高，使其成本高昂，在國內的售價10支約為2500-3200元，而且無法滅菌，只能一次性使用，這樣的成本對于我國的大多數實驗室的基礎研究需要是極不相適應的。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種多能干細胞的傳代方法，解決了現有傳代方法成本高、穩定性差的問題。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：一種多能干細胞的傳代方法，該方法通過以下步驟實現：

S1、在培養皿中培養多能干細胞，得到多能干細胞集落；

S2、將達到70～80％融合的hES移除培養皿中的培養基，并使傳代工具在盛有培養基的培養皿表面移動，從右至左，依次推滾傳代工具；

S3、水平轉動所述培養皿的方向，并重復所述S2的工序，獲得切割后的多能干細胞片；

S4、向所述培養皿中加入的解離液，并放入36～38℃、5％CO₂培養箱孵育3～7min，獲得收縮后的多能干細胞片；

S5、吹次所述培養皿的底部，洗脫所述收縮后的多能干細胞片，并移入離心管中；

S6、加入所述解離液，并重復所述S5的工序，獲得洗脫后的多能干細胞片；

S7、對所述洗脫后的多能干細胞片進行離心，去除上清液，得到離心后的多能干細胞；

S8、向所述離心后的多能干細胞中加入新的培養基重懸后，再按照1：(4～6)的比例將重懸后的多能干細胞接種到新的培養皿中，即完成了多能干細胞的傳代。

優選地，所述S2中，所述傳代工具為一彈簧切割器，所述彈簧切割器包括精密彈簧、滾軸和鑷子，所述滾軸的外側壁上設置有卡槽，使用時，將所述精密彈簧套設在滾軸上，并將所述鑷子的端部嵌入滾軸外側壁上的卡槽中，用于壓縮精密彈簧和調節精密彈簧間距。