[發(fā)明專利]一種探針引物及其用于平貝母專屬性檢測的熒光定量PCR檢測方法和用途在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210187701.5 | 申請日： | 2022-02-28 |
| 公開（公告）號： | CN114540346A | 公開（公告）日： | 2022-05-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張文娟;魏鋒;馬雙成;程顯隆;石巖;于健東;陸以云 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國食品藥品檢定研究院 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京攀騰專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11374 | 代理人： | 彭蓉;游舜華 |
| 地址： | 100050*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 探針 引物 及其 用于 貝母 專屬 檢測 熒光 定量 pcr 方法 用途 | ||
本發(fā)明提供了一種探針引物及其用于平貝母專屬性檢測的熒光定量PCR檢測方法和用途。所述探針引物是由SEQ ID NO：28?39所示的DNA序列組成。所述檢測方法可有效檢出平貝母，專屬性強，靈敏度高，可用于藥材、飲片或成方制劑中是否存在平貝母的定性或定量檢測，具有重要的實用價值和應(yīng)用前景。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及藥物鑒別檢測方法，尤其涉及一種探針引物及其用于平貝母專屬性檢測的熒光定量PCR檢測方法和用途。
背景技術(shù)
貝母類藥材是常用大宗藥材，具有止咳化痰功效，其中川貝母、伊犁貝母和平貝母均收錄于《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)，傳統(tǒng)認為川貝母效果最佳，且以野生為主，價格在各種貝母藥材中居首位；而伊犁貝母和平貝母為種植品，產(chǎn)量較大，價格較低。《中國藥典》川貝母的基原來源收錄了百合科植物的6個物種，即川貝母Fritillariacirrhosa D.Don、暗紫貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂貝母F.delavayi Franch.、太白貝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen，按性狀差異又可分為松貝、青貝、爐貝及栽培品。
川貝母市場需求量較大，但野生資源有限，偽品屢見不鮮。常見偽品來源主要有伊犁貝母和平貝母等。川貝母摻偽現(xiàn)象嚴重擾亂了公平競爭的市場秩序，影響著用藥的安全性和有效性，最終侵害了消費者的經(jīng)濟和健康利益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種探針引物及其用于平貝母專屬性檢測的熒光定量PCR檢測方法和用途。所述檢測方法可有效檢出平貝母，專屬性強，靈敏度高，可用于藥材、飲片或成方制劑中是否存在平貝母的定性或定量檢測，具有重要的實用價值和應(yīng)用前景。
一方面，本發(fā)明提供了一種探針引物。所述探針引物其由SEQ ID NO：28-39所示的DNA序列組成。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于平貝母專屬性檢測的熒光定量PCR檢測方法。所述方法包括下述步驟：
稱取貝母樣品及樣品前處理；
從所述樣品中提取DNA并制備DNA模板；及
選擇探針引物；
優(yōu)化反應(yīng)條件；
根據(jù)不同的檢測需求，設(shè)定不同的判定依據(jù)；其中對于定性檢測，根據(jù)設(shè)定的CT值臨界點(如CT35)判定是否檢出；對于半定量檢測，根據(jù)與陽性對照的CT值之差的絕對值作為判定依據(jù)，差值越小，含量越高；對于定量檢測，一方面同時設(shè)置標準品(S)，另一方面采用同體系中雙探針標記進行擴增，即包括目的探針(P)和內(nèi)參探針(C)；供試品中目的探針(P)和內(nèi)參探針(C)的定量檢測比值可表示為△CT(T)，相應(yīng)的標準品可表示為△CT(S)，△△CT＝△CT(T)-△CT(S)從而目的DNA(伊犁貝母或者平貝母)所占比例計算公式可表示為：
其中，所述方法能夠用于檢測所述樣品中是否含有平貝母；所述探針引物為序列號為SEQ ID NO28-39的探針引物。
在一些實施方式中，每組探針引物包括三個序列，并且當任何一組用于檢測時其中所包括的三個序列是同時使用而不拆分。
在一些實施方式中，所述樣品為中藥材、飲片或成方制劑。
在一些實施方式中，所述提取DNA的步驟采用紫外分光光度法進行定量和純度測定。
在一些實施方式中，所述反應(yīng)條件包括：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30～60s，60℃收集熒光。根據(jù)所選反應(yīng)預(yù)混液性質(zhì)的不同，反應(yīng)條件可進行調(diào)整。
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