[發(fā)明專利]一種抗逆性強(qiáng)的萊茵衣藻表達(dá)蛋白的方法

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• 申請日: 2022-02-28
• 公開（公告）號: CN114574515A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳寅嵩;譚瑩瑩;萬民熙;陳麗麗;李素雯;曹煜梟
• 申請（專利權(quán)）人: 修實生物醫(yī)藥（南通）有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/12;C07K14/47;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 濟(jì)南市易拓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37325
• 代理人: 江莉莉

本發(fā)明為提高萊茵衣藻的抗逆性，解決其對生長環(huán)境敏感的問題，通過對其進(jìn)行基因重組改造，引入抗逆基因，從而實現(xiàn)其魯棒性提升的技術(shù)效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于海洋微藻，涉及一種萊茵衣藻，具體涉及一種抗逆性強(qiáng)的萊茵衣藻表達(dá)蛋白的方法。

背景技術(shù)

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是帶有兩條鞭毛和一個占細(xì)胞總體積40％左右杯狀葉綠體的真核單細(xì)胞生物，隸屬于綠藻門團(tuán)藻目衣藻屬。因為其遺傳背景清楚，便于進(jìn)行遺傳改造等特點廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中，例如鞭毛運動、光合作用、葉綠體功能等。由于衣藻培養(yǎng)方便，生長速度快，可以進(jìn)行光合作用等優(yōu)勢成為了生物反應(yīng)器的理想選擇。另外，衣藻具有的翻譯后修飾、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的靶向定位、重組蛋白外分泌等的特點，為其生產(chǎn)外源重組蛋白提供了便利的條件。萊茵衣藻擁有細(xì)胞核、葉綠體、線粒體三套基因組，并且是唯一三套基因組均可遺傳轉(zhuǎn)化的光合單細(xì)胞生物。核基因組轉(zhuǎn)化相比葉綠體轉(zhuǎn)化來說具有轉(zhuǎn)化效率高，性狀可以穩(wěn)定遺傳，重組蛋白可以糖基化等的特點。但是，衣藻培養(yǎng)對環(huán)境相對敏感，魯棒性是差于大腸桿菌和酵母的。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象。有許多分子有助于啟動和調(diào)控細(xì)胞凋亡。首先在b細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族是一個重要的能促進(jìn)或抑制凋亡事件的一組蛋白質(zhì)家族。這些蛋白質(zhì)已在哺乳動物細(xì)胞中被很好地表征。Bcl-xL是屬于Bcl-2家族的30kDa抗凋亡蛋白，通過兩種不同的機(jī)制防止凋亡：通過與凋亡蛋白異源二聚化來抑制其凋亡作用，以及通過對線粒體外膜的直接成孔作用來幫助維持應(yīng)激條件下的正常膜狀態(tài)。Bcl-xL可以在凋亡激活后被胱天蛋白酶裂解，從而將Bcl-xL從抗凋亡蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龅牧呀猱a(chǎn)物。Bcl-xL的裂解產(chǎn)物在線粒體膜上形成細(xì)胞色素C釋放孔，以促進(jìn)凋亡信號通路。Bcl-xL是在某些淋巴瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的基因，現(xiàn)在已明確能強(qiáng)抑制細(xì)胞凋亡。

本發(fā)明在萊茵衣藻中表達(dá)抗凋亡基因Bcl-xL，抑制了其凋亡，大幅提高了該藻的魯棒性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗逆性強(qiáng)的萊茵衣藻及采用該萊茵衣藻表達(dá)蛋白的方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種抗逆性強(qiáng)的萊茵衣藻的制備方法，其特征在于，制備方法包括：

(1)抗凋亡基因與目的基因的連接；

(2)表達(dá)載體的構(gòu)建；

(3)擴(kuò)增及質(zhì)粒提取；

(4)電轉(zhuǎn)化及檢測；

進(jìn)一步地，步驟(4)后還包含以下步驟：

(5)擴(kuò)培；

優(yōu)選地，所述抗凋亡基因為Bcl-xL，

其中，所述Bcl-xL核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：