[發明專利]一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法

在審

• 申請號: 202210180976.6
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114657227A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 韓詩蕾;衛娜;廖金華;呂琪
• 申請（專利權）人: 翁源廣業清怡食品科技有限公司;廣東廣業清怡食品科技股份有限公司
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12P19/18;C12N9/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 李海波;劉艷麗

1.一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征在于：使用糖基轉移酶催化生產萊鮑迪苷D，所述糖基轉移酶如下所述：

(1)糖基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，經過取代、缺失或者添加一個或一個以上氨基酸，獲得比SEQ ID NO.1更高催化活性的糖基轉移酶。

2.根據權利要求1所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征在于：所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少有如下一個或一個以上位點的突變：第88、92、95、121、150、181、191、364位。

3.根據權利要求2所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征在于：所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中至少有如下一個或一個以上突變：T88S、T88Q、T88L、H92N、H92S、H92V、R95H、R95A、R95G、F121V、F121P、F121M、F150T、Y181C、Y181L、Y181I、F191S、F191L、F191E、F364S。

4.根據權利要求1-3任一項所述高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將表達有權利要求1-3任一項中所述糖基轉移酶的基因工程菌進行發酵，得發酵液，將發酵液離心，收集菌體，將菌體破碎，離心，取上清，得到含有糖基轉移酶的粗酶液；

(2)選取萊鮑迪苷A和蔗糖混合溶液作為反應底物，加入步驟(1)中的粗酶液，在20～40℃溫度條件下反應10～48h，然后高溫滅酶，終止反應，得到含萊鮑迪苷D反應液；

(3)選取步驟(2)中的含萊鮑迪苷D反應液，離心取沉淀，加入純水攪拌水洗，然后離心，取沉淀，得到萊鮑迪苷D粗品；

(4)選取步驟(3)得到的萊鮑迪苷D粗品，加入乙醇水溶液，攪拌溶解，離心取上清，得到萊鮑迪苷D乙醇混合溶液；

(5)將步驟(4)中的萊鮑迪苷D乙醇混合溶液蒸發回收乙醇，得到萊鮑迪苷D水溶液，將萊鮑迪苷D水溶液離心，取下層沉淀，干燥，得到高純度萊鮑迪苷D。

5.根據權利要求4所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征是：步驟(1)中將表達有糖基轉移酶的基因工程菌進行發酵的過程為：將表達有糖基轉移酶的基因工程菌接種至LB培養基中，150～250r/min搖床培養6～10h，以2～5％(V/V)的接種量接種至TB發酵培養基中進行發酵培養，通氣量為0.5～1.5VVM，攪拌轉速為350～600rpm，在37℃發酵2～6h后，降溫至15～25℃繼續誘導8～24h，得到發酵液。

6.根據權利要求4所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征是：步驟(1)中將發酵液離心時采用碟片式離心機離心，離心轉速為2500～4000rpm/min，離心溫度5～10℃，離心時間5～10min；步驟(1)中將菌體破碎時采用高壓均質機破碎，高壓均質機工作時的壓力為700～1000Bar，溫度5～10℃，循環破碎2～4次。

7.根據權利要求4所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征是：步驟(2)中所述萊鮑迪苷A和蔗糖混合溶液中，所述萊鮑迪苷A的濃度為20～100g/L，其中采用的萊鮑迪苷A原料的質量百分含量為90％以上，所述蔗糖的濃度為20～200g/L；步驟(2)中所述反應底物與所述粗酶液的體積比為1：0.5～5；步驟(2)中高溫滅酶是在90℃高溫下滅酶10～20分鐘。

8.根據權利要求4所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征是：步驟(3)中沉淀與純水的用量關系為1g：1～5mL；步驟(4)中所述萊鮑迪苷D粗品與所述乙醇水溶液的用量關系為1g：1～10mL，其中所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為40～80％。

9.根據權利要求4所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征是：步驟(5)中蒸發回收乙醇時溫度為30～45℃；步驟(5)中干燥是在50～60℃溫度條件下鼓風干燥6～12h；步驟(5)中高純度萊鮑迪苷D的純度≥95％(w/w)。

10.根據權利要求4所述的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，其特征是：步驟(1)中離心時離心機轉速為4000～6000rpm/min；步驟(3)～(5)中離心時離心機的轉速為4000～6000rpm/min。