[發明專利]一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法

在審

• 申請號: 202210180976.6
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114657227A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 韓詩蕾;衛娜;廖金華;呂琪
• 申請（專利權）人: 翁源廣業清怡食品科技有限公司;廣東廣業清怡食品科技股份有限公司
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12P19/18;C12N9/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 李海波;劉艷麗

本發明公開了一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法，使用糖基轉移酶催化生產萊鮑迪苷D，所述糖基轉移酶如下所述：(1)糖基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，經過取代、缺失或者添加一個或一個以上氨基酸，獲得比SEQ ID NO.1更高催化活性的糖基轉移酶。該方法利用生物酶催化技術制備高純度萊鮑迪苷D的方法，可以突破天然提取法的限制，實現萊鮑迪苷D的規模化生產，得到純度高于95％的萊鮑迪苷D。

技術領域

本發明屬于萊鮑迪苷D技術領域，具體涉及一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法。

背景技術

隨著人們對健康的日漸關注，全球多國紛紛針對減糖推出各項政策，各類代糖在近年來得到了快速發展。甜菊糖是一種高甜度、低熱量的天然甜味劑。國內外大量毒理學實驗結果表明，甜菊糖苷攝入人體后以原形經糞便和尿液排出，無致畸形，致突變，致癌性，且不被體內微生物代謝，而且對糖尿病、肥胖癥、心臟病和高血壓有明顯的藥理作用和輔助療效，已經FDA批準使用，是目前國內外公認的可替代蔗糖的理想健康新糖源，在國際上被譽為“世界第三糖源”和目前已知的最甜的天然糖料，現已廣泛應用于保健飲料、低熱值食品和醫藥工業中。甜菊糖在我國生產應用已經有近30年的歷史，我國甜菊糖產業發展迅速，目前已經成為世界最大的甜菊糖生產國和出口國。然而，市售甜菊糖是多種糖苷的混合物，其組分復雜，甜味質相對較差，后味略帶甘苦味和甘草異味，在食品工業中的應用和出口都受到了較大的限制。

萊鮑迪苷D是甜葉菊中一種含量較低的糖苷，與甜菊糖組份中其它糖苷相比，其甜度高，約為蔗糖的400倍，且甜味純正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草異味低，穩定性好，是一種理想的天然高倍甜味劑產品，因此成為多家國際甜味劑大公司的重點研究和推廣產品。然而，在甜葉菊中，萊鮑迪苷D的含量僅占0.5％，利用天然提取法生產萊鮑迪苷D成本昂貴，限制了萊鮑迪苷D在食品中的廣泛應用。利用生物酶法生產萊鮑迪苷D，是目前國內外甜菊糖廠家重點突破方向。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法，該方法利用糖基轉移酶催化生產高純度萊鮑迪苷D，可以突破天然提取法的限制，實現萊鮑迪苷D的規模化生產，得到純度高于95％的萊鮑迪苷D。

本發明的上述目的可以通過以下技術方案來實現：一種高純度萊鮑迪苷D的制備方法，使用糖基轉移酶催化生產萊鮑迪苷D，所述糖基轉移酶如下所述：

(1)糖基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，經過取代、缺失或者添加一個或一個以上氨基酸，獲得比SEQ ID NO.1更高催化活性的糖基轉移酶。

優選的，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少有如下一個或一個以上位點的突變：第88、92、95、121、150、181、191、364位。

優選的，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中至少有如下一個或一個以上突變：T88S、T88Q、T88L、H92N、H92S、H92V、R95H、R95A、R95G、F121V、F121P、F121M、F150T、Y181C、Y181L、Y181I、F191S、F191L、F191E、F364S。

進一步的，本發明提供的高純度萊鮑迪苷D的制備方法，包括以下步驟：

(1)將表達有上述糖基轉移酶的基因工程菌進行發酵，得發酵液，將發酵液離心，收集菌體，將菌體破碎，離心，取上清，得到含有糖基轉移酶的粗酶液；

(2)選取萊鮑迪苷A和蔗糖混合溶液作為反應底物，加入步驟(1)中的粗酶液，在20～40℃溫度條件下反應10～48h，然后高溫滅酶，終止反應，得到含萊鮑迪苷D反應液；

(3)選取步驟(2)中的含萊鮑迪苷D反應液，離心取沉淀，加入純水攪拌水洗，然后離心，取沉淀，得到萊鮑迪苷D粗品；