[發明專利]一種人源膜聯蛋白人源膜聯蛋白A5突變體二聚體的晶體結構及其解析方法

在審

• 申請號: 202210178427.5
• 申請日: 2022-02-24
• 公開（公告）號: CN114437197A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 華子春;唐薇
• 申請（專利權）人: 江蘇靶標生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;G16C20/50
• 代理公司: 江蘇銀創律師事務所 32242
• 代理人: 何震花

本發明公開了一種人源膜聯蛋白A5突變體二聚體的晶體結構及其解析方法，所述的人源膜聯蛋白A5突變體二聚體的晶體結構的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的人源膜聯蛋白突變體二聚體的晶體結構的一個晶格由4個蛋白分子組成，分別為：chain A、chain B、chain C、chain D；所述的蛋白晶體每個單分子含有4個repeat，所述的每個repeat由5個α螺旋和連接它們的loop組成。本發明所提供的突變體蛋白的結構信息可以用于更高效地開展制備檢測試劑、診斷試劑盒制備、藥物靶點篩選和治療效果更好的變體蛋白研發，滿足生物制藥應用的要求。

技術領域

本發明涉及醫藥工程技術領域，具體涉及一種人源膜聯蛋白A5突變體二聚體的晶體結構及其解析方法。

背景技術

研究表明，膜聯蛋白A5(Annexin A5)簡稱ANXA5，是一種320個氨基酸組成的單鏈蛋白，研究早期其又被稱為胎盤抗凝蛋白I、凝血酶抑制劑V、內皮素II、鈣結合蛋白I和脂皮質素V。早在1985年，研究報道將其描述為血管抗凝劑，之后它又成為第一個被表征三維結構的膜聯蛋白，表明對其的結構解析具有十分重要的研究價值。

研究表明，ANXA5蛋白結構重復序列I至IV組成，其蛋白序列226位上的ASP以Ca2+和pH依賴的構象方式參與調控分子開關。ANXA5與Ca2+結合時的構象，發現在ANXA5重復序列III第187位上暴露的Trp與磷脂結合，此外，ANXA5內部的域間形成了由I/IV和II/III組成的交互作用方式。其中，I和IV之間的相互作用是由NH2末端以非共價方式介導產生，而重復序列II和III通過短螺旋轉動方式共價連接。

研究表明，ANXA5是一種單體結構，但與磷脂膜結合時，三個ANXA5單體會自發形成三聚體，而形成的三聚體可以通過三聚體-三聚體相互作用的方式在暴露有磷脂酞絲氨酸(PS)的表面組裝。在涉及到抗炎、纖溶和抗血栓過程中，細胞內的ANXA5會在二維晶格中自組裝，進而改變細胞膜的曲率以及細胞形狀，最終促進細胞膜的修復。

研究表明，細胞內的ANXA5在質膜上表現出鈣通道活性，它能與血小板中的肌動蛋白相互作用，是凝血過程的關鍵調節因子。另外，在血液凝固過程中需要血小板的激活，以形成一個以PS為主的磷脂膜催化表面，使凝血因子X、凝血酶原等凝血固子活化。由于膜聯蛋白具有較強的鈣依賴性磷脂結合活性，因而能夠競爭性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的結合，從而抑制了凝血因子X等的活化，起到抗凝血的作用。

綜上所述，Annexins是一類鈣離子依賴型的磷脂結合蛋白，能夠調控抗凝血、細胞凋亡、信號轉導等過程，并參與多種疾病的發生發展。ANXA5是膜聯蛋白家族分布最多和最廣泛的成員，最早被稱為抗凝蛋白，主要起抗凝血的功能，通常作為抗凝劑和抗血栓形成的藥。近幾年，對于尋找與PS結合能力更強、抗血栓能力更強和毒性更小的ANXA5突變體成為研究熱點。本發明提供了一個構建此類突變體的新思路，即通過在ANXA5的C末端添加一個半胱氨酸，能夠通過形成分子間的二硫橋的構建提高分子間的聚集作用，在競爭性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的結合中發揮更強的作用。

目前，X-射線單晶衍射方法是通過蛋白質單晶獲得其三維結構的最重要的研究方法之一。對于X-射線單晶衍射方法，蛋白質單晶必須達到足夠大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白質分子之間的相互作用位點較少，相互作用力比較弱，蛋白質晶體中往往含有很大比重的水，因此，內部結構比較規整的蛋白質晶體仍舊很難獲得。獲得高質量的蛋白質晶體仍舊是蛋白質結構解析的瓶頸問題。

發明內容

本發明提供了一種低毒性、高活性的人源膜聯蛋白A5突變體二聚體的晶體結構及其解析方法。

本發明提供的一種低毒性、高活性的人源膜聯蛋白A5突變體二聚體，與人源膜聯蛋白A5相比較，其毒性大大降低、安全性顯著提高；人源膜聯蛋白A5突變體二聚體蛋白的PS結合能力是人源膜聯蛋白A5的4.5倍。