[發明專利]一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法

在審

• 申請號: 202210176914.8
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114350765A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 楊林林;初雷霞;喬璐;蘇秀紅;董誠明
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 余王敏

本發明公開了一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，屬于熒光定量PCR方法領域，旨在解決針對現有技術不足，缺少一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物及實時熒光定量PCR方法，無法對北柴胡NCED基因進行快速、高效、高靈敏度的檢測的問題。通過提取北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)的總RNA，以北柴胡actin基因為內參基因進行對照，開展實時熒光定量PCR檢測，并采用2^?ΔΔCt法檢測分析NCED基因在北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)中的分布與表達差異，能夠實現對北柴胡不同組織的NCED基因進行實時熒光定量PCR檢測，并具有快速、高效、高靈敏度的特點，同時對于研究北柴胡抗干旱逆境脅迫相關機制的研究具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及熒光定量PCR方法領域，具體為一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法。

背景技術

北柴胡(Bupleurum chinense DC.)是傘形科柴胡屬植物，以北柴胡為基原之一的柴胡是我國大宗中藥材，其處方率高，有小柴胡湯等多個處方使用。目前，北柴胡主要分布于我國干旱、半干旱地區，其地理跨度大、分布范圍廣，其生長發育受到外部環境的影響。植物在生長發育各個階段，會通過不同的植物激素調節自身代謝，從而適應外界環境的改變。植物激素如脫落酸等參與調控植物整個的生命周期，在調控植物生長發育和代謝活動中起著非常重要的作用。其中NCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)是植物體中一種9-順式-環氧類胡蘿卜素二雙加氧酶，是催化植物體內脫落酸生物合成的關鍵酶，由NCED參與催化合成的脫落酸參與到北柴胡對干旱、半干旱逆境的適應過程中，在北柴胡抗逆性方面發揮著重要作用。

為此，檢測NCED基因在北柴胡植物組織內的表達變化，對于研究北柴胡抗干旱逆境脅迫機理具有重要意義。然而，目前還未見有關北柴胡NCED基因實時熒光定量PCR檢測方法的系統報道。基于上述情況，本文針對現有技術不足，探索開發一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物及實時熒光定量PCR方法，可以對北柴胡NCED基因進行快速、高效、高靈敏度的檢測。

發明內容

鑒于現有技術中所存在的問題，本發明公開了一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，采用的技術方案是，包括以下步驟：

步驟1，北柴胡目的基因NCED的實時熒光定量引物設計：

利用如SEQ ID NO.1所示北柴胡NCED基因的序列，設計引物；

步驟2，北柴胡內參基因actin的實時熒光定量引物設計：

利用如SEQ ID NO.2示北柴胡actin基因的序列，設計引物；

步驟3，北柴胡不同植物組織cDNA逆轉錄：

提取北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)的總RNA，并將提取的不同組織的總RNA分別逆轉錄成cDNA，-20℃保存備用；

步驟4，北柴胡NCED基因的實時熒光定量PCR檢測：

以逆轉錄的cDNA為模板，以actin為內參基因，在QuantStudio 5AppliedBiosystems上對北柴胡NCED基因的表達水平進行檢測，分析NCED基因在北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)中的分布與表達差異。

作為本發明的一種優選技術方案，所述步驟1中，利用SEQ ID NO.1所示北柴胡NCED基因序列，通過Primer Premier5軟件，設計出產物片段大小在80～200bp，退火溫度55℃的引物序列。

作為本發明的一種優選技術方案，所述步驟2中，利用SEQ ID NO.2所示北柴胡actin基因序列，通過Primer Premier5軟件，設計出產物片段大小在80～200bp，退火溫度55℃的引物序列。