[發明專利]一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法

在審

• 申請號: 202210176914.8
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114350765A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 楊林林;初雷霞;喬璐;蘇秀紅;董誠明
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 余王敏

1.一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1，北柴胡目的基因NCED的實時熒光定量引物設計：

利用如SEQ ID NO.1所示北柴胡NCED基因的序列，設計引物；

步驟2，北柴胡內參基因actin的實時熒光定量引物設計：

利用如SEQ ID NO.2所示北柴胡actin基因的序列，設計引物；

步驟3，北柴胡不同植物組織cDNA逆轉錄：

提取北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)的總RNA，并將提取的不同組織的總RNA分別逆轉錄成cDNA，-20℃保存備用；

步驟4，北柴胡NCED基因的實時熒光定量PCR檢測：

以逆轉錄的cDNA為模板，以actin為內參基因，在QuantStudio 5 Applied Biosystems上對北柴胡NCED基因的表達水平進行檢測，分析NCED基因在北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)中的分布與表達差異。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟1中，利用SEQ ID NO.1所示北柴胡NCED基因序列，通過PrimerPremier5軟件，設計出產物片段大小在80～200bp，退火溫度55℃的引物序列。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟2中，利用SEQ ID NO.2所示北柴胡actin基因序列，通過PrimerPremier5軟件，設計出產物片段大小在80～200bp，退火溫度55℃的引物序列。

4.根據權利要求1所述的一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟3中，采集北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)樣本，蒸餾水清洗干凈后用吸水紙吸去水分，迅速投入到液氮中進行保存；利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒對北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)樣本的總RNA分別進行提取，取1～10微升總RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒進行反轉錄生成cDNA，-20℃保存備用。

5.根據權利要求1所述的一種用于檢測北柴胡NCED基因的引物和實時熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟4中，利用TaKaRa Premix Ex Taq^TM試劑盒，以北柴胡不同組織(根、莖、葉、花)樣本cDNA為模板，開展北柴胡NCED基因的實時熒光定量PCR檢測，以北柴胡actin基因為內參基因進行對照，采用2^-ΔΔCt法檢測北柴胡NCED基因在不同組織(根、莖、葉、花)中的分布與表達情況。

6.根據權利要求1所述的一種北柴胡NCED基因的熒光定量PCR引物，其特征在于：所述引物包括：

上游引物SEQ ID NO.3：5′-GATTCTTCATCCTCCTCTGC-3′；

下游引物SEQ ID NO.4：5′-CGATAACATTTTCAACTGCG-3′，

該引物是所述檢測方法步驟1所設計引物的一種但不僅有這一種。

7.根據權利要求1所述的一種北柴胡actin基因的熒光定量PCR引物，其特征在于：所述引物包括：

上游引物SEQ ID NO.5：5′-TGGGATGACATGGAGAAGAG-3′；

下游引物SEQ ID NO.6：5′-AGAAAGAACAGCCTGGATTG-3′，

該引物是所述檢測方法步驟2所設計引物的一種但不僅有這一種。