[發明專利]一種酶催化甲基腰果酚的制備方法

在審

• 申請號: 202210176560.7
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114457124A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 陳小龍;呂旭浩;周家偉;陸躍樂;朱林江
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P7/00
• 分類號: C12P7/00;C12N15/70;C12N15/54;C12N9/10
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明屬于酶催化技術領域，具體涉及一種酶催化甲基腰果酚的制備方法，包括以下步驟：首先合成出甲基轉移酶的原始基因，對其進行優化、重組，將重組的表達載體轉移到菌株中進行表達，對表達菌株進行培養，然后破碎，得到含重組甲基轉移酶菌體破碎液。向反應器中加入腰果酚、甜菜堿、重組甲基轉移酶菌體破碎液、磷酸鹽緩沖液，調節pH值、溫度，反應后得到甲基腰果酚；本發明提供的酶催化甲基腰果酚的制備方法，制備出了一定轉化率的甲基腰果酚，不使用易燃易爆物質硫酸二甲酯和碘甲烷，環境友好，對于安全生產具有十分重要的意義。

技術領域

本發明涉及酶催化技術領域，尤其涉及一種酶催化甲基腰果酚的制備方法。

背景技術

天然腰果殼液(油)中含有腰果酸、腰果酚、強心酚和二甲基強心酚4種主要成分，其中腰果酸占90％，腰果酸在高溫條件下會進行脫酸，使腰果酸轉變為腰果酚，關于腰果酚的提取，目前已有許多報道的方法用于提取高純度的腰果酚。腰果酚，是一種非常重要的工業烷基酚醛化合物，雖然其芳香環結構具有有益的化學耐性，長鏈脂肪酸碳鏈使得腰果酚具有脂肪族化合物的耐水性和耐溫性，但是腰果酚因其苯酚基團的存在，仍具有酚類物質的危險性特征，并且具有皮膚腐蝕性。

腰果酚的結構式：

腰果酚經過衍生化之后，可以降低其腐蝕性，有研究表明甲基腰果酚具有部分抗原蟲活性。現有技術中，實驗室里用化學法進行甲基轉移，如以碘甲烷為甲基供體；或以硫酸二甲酯為甲基供體，但是這些化學法安全系數低、成本高、環境污染大且碘甲烷和硫酸二甲酯存在易燃易爆等問題。

發明內容

基于現有技術中存在的上述缺點和不足，本發明的目的之一是至少解決現有技術中存在的上述問題之一或多個，換言之，本發明的目的之一是提供滿足前述需求之一或多個的一種酶催化甲基腰果酚的制備方法。

為了達到上述發明目的，本發明采用以下技術方案：

甲基轉移酶催化制備甲基腰果酚的反應路線為（腰果酚三烯為例）：

一種酶催化甲基腰果酚的制備方法，具體如下：

向反應器中加入腰果酚、甜菜堿、重組甲基轉移酶、磷酸鹽緩沖液，調節pH值、溫度，反應后得到甲基腰果酚。

作為優選方案，所述甜菜堿濃度為20~50g/L。

作為優選方案，所述腰果酚與混合溶液的固液比為50~125g/L。

作為優選方案，所述pH值利用pH自動控制系統和1 M Na₂CO₃溶液控制酶反應的pH值在6.8~8.9之間。

作為優選方案，所述溫度在28-35 ℃，反應時間不低于7小時。

作為優選方案，所述磷酸鹽緩沖液濃度為0.08~0.12 M，pH為7。

作為優選方案，所述重組甲基轉移酶是由菌株用離心機離心，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎后所得。

作為優選方案，所述菌株是經過優化甲基轉移酶OMT3原始基因序列，得到OMT3基因序列，對其進行目的基因全合成后，連接到pET28a(+)上，得到載體pET28a-OMT3，將載體pET28a-OMT3轉化到菌株BL21(DE3)中，挑取單菌落接入到卡那霉素的LB培養基中，振蕩培養，得到種子液，種子液加入發酵培養基中后，添加IPTG，培養所得。

作為優選方案，所述LB培養基包括蛋白胨、酵母提取物、NaCl、去離子水。

作為優選方案，所述發酵培養基包括蛋白胨、酵母提取物、甘油、KH₂PO₄、K₂HPO₄、去離子水。

優化后的OMT3基因序列為：