[發明專利]一種基于電穿孔的細胞膜包覆磁珠垂釣中藥活性成分的方法及其應用

在審

• 申請號: 202210176517.0
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114544930A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 張雅;譚光國;周倩;廖文婷;王超麗
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍空軍軍醫大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C12Q1/02;B01J20/24;B01J20/30;B01J20/28
• 代理公司: 西安創知專利事務所 61213
• 代理人: 馬小燕

本發明公開了一種基于電穿孔的細胞膜包覆磁珠垂釣中藥活性成分的方法，該方法包括：一、采用包覆和修飾合成Fe₃O₄@BSA?RDG磁性納米顆粒；二、采用電穿孔制備完整巨噬細胞膜包覆納米磁珠；三、垂釣中藥活性成分；本發明還公開了上述方法在垂釣附子活性成分的應用。本發明通過合成生物相容性好兼具膜靶向的Fe₃O₄@BSA?RGD磁性納米顆粒，并與靶細胞巨噬細胞共培養后進行電穿孔，構建完整巨噬細胞膜包覆納米磁珠體系，保證了細胞膜的結構完整性和外表面朝外，相對傳統包覆方法不區分膜外/內表面朝向，增加垂釣載體表面靶點數量，提高了對中藥活性成分篩選的準確性和靈敏度；本發明的應用實現了對附子中抗炎活性成分的垂釣。

技術領域

本發明屬于中藥活性成分篩選技術領域，具體涉及一種基于電穿孔的細胞膜包覆磁珠垂釣中藥活性成分的方法及其應用。

背景技術

傳統中藥活性成分研究通常采用生物效應導向的系統分離結合藥理實驗確定。中藥成分復雜，并且有效成分含量往往低微，因此其分離分析操作煩瑣，工作量大，周期長，成功率低，而且分解和忽視了中藥“多組分-多靶點”整體作用的本質。

尋找活性成分快速篩選方法和技術一直是國內外制藥公司關注的焦點。迄今為止，已明確的藥物靶標超過500個，其中超過50%的藥物以膜受體為靶標。因此，以膜受體靶標為核心的藥物直接篩選已成為發現先導化合物的有效方法。近年來，以磁性納米微球為載體，使用細胞膜囊泡作為功能涂層，制備細胞膜功能化磁性納米微球，在外加磁場的定向控制下，利用其磁響應性和膜表面親和基團高選擇性，從復雜的生物體系中“垂釣”出活性物質，已成功用于中藥中細胞膜結合活性成分的篩選。然而，膜受體包覆磁珠的制備是制約該技術發展的瓶頸。

傳統的細胞膜包覆磁性納米微球的方法需要通過兩步實現：第一步是超聲破碎細胞，制備細胞膜碎片；第二步是機械攪拌或超聲作用下磁性納米微球與細胞膜碎片充分混合后靜置，通過磁性微球物理吸附細胞膜的磷脂雙分子層，進而在其表面形成均勻的細胞膜層。盡管傳統的方法可以有效地將細胞膜包覆于磁性納米微球表面，然而仍然面臨以下兩方面問題：一是超聲處理/機械力作用破壞了細胞膜的完整性，降低了細胞膜的功能，從而可能導致膜蛋白構象的改變甚至變性，降低藥物篩選結果的準確性；二是這種物理吸附過程由于無法區分細胞膜內/外表面，導致藥物篩選位點不明確，同時由于細胞膜內/外表面受體同時存在，單位面積藥物篩選位點減少，降低了相關篩選方法的靈敏度。這些問題限制了細胞膜包覆磁珠垂釣方法的進一步開發和應用。由于細胞膜外表面含有大量藥物靶點的配體結合域，因此，建立一種外表面朝外的完整細胞膜包覆納米磁珠垂釣中藥活性成分的方法具有重要意義。

細胞膜電穿孔技術（Electroporation）是在短時外加電場的作用下，細胞膜出現暫時微孔，通透性增大的物理過程。該過程使得一些原本無法穿過細胞膜的分子可以自由地進出細胞，電場取消后微孔關閉而不會對細胞造成任何影響，這一特性使得電穿孔技術目前廣泛用于基因轉染和膜偽裝納米遞藥體系的構建，在細胞膜垂釣中藥活性成分研究領域暫時還未廣泛涉及。

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是臨床常見的一種以侵蝕性關節炎為主要癥狀，多種靶細胞參與的自身免疫性疾病。巨噬細胞因分泌促炎因子、趨化因子及組織降解酶等具有多方面作用而處于類風濕關節炎免疫細胞的核心地位。巨噬細胞已成為類風濕性關節炎治療的重要靶細胞，其膜上受體是抗類風濕性關節炎活性物質發揮作用的重要靶點。附子能溫補腎陽、祛風散寒，具有抗炎、鎮痛等藥理活性，臨床上用于治療關節炎，然而其抗炎活性成分仍不清楚。

發明內容