[發明專利]一種基于電穿孔的細胞膜包覆磁珠垂釣中藥活性成分的方法及其應用

在審

• 申請號: 202210176517.0
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114544930A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 張雅;譚光國;周倩;廖文婷;王超麗
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍空軍軍醫大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C12Q1/02;B01J20/24;B01J20/30;B01J20/28
• 代理公司: 西安創知專利事務所 61213
• 代理人: 馬小燕

1.一種基于電穿孔的細胞膜包覆磁珠垂釣中藥活性成分的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、Fe₃O₄@BSA-RDG磁性納米顆粒的合成

步驟101、Fe₃O₄磁性納米顆粒的合成：在全程氮氣保護下，首先將乙酰丙酮鐵在磁力攪拌下溶解于油胺與油酸的混合溶液中，得到乙酰丙酮鐵溶液，然后將N-甲基吡咯烷酮在機械攪拌下加熱回流，再將乙酰丙酮鐵溶液逐滴加入到加熱回流后的N-甲基吡咯烷酮中進行反應，冷卻至室溫后經磁分離、洗滌，得到Fe₃O₄磁性納米顆粒；

步驟102、Fe₃O₄@BSA磁性納米顆粒的合成：將牛血清白蛋白和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽在室溫下攪拌得到BSA溶液，然后將步驟101中得到的Fe₃O₄磁性納米顆粒加入到BSA溶液中繼續攪拌反應，再依次經磁分離、洗滌和冷凍干燥，得到牛血清白蛋白包覆的Fe₃O₄磁性納米顆粒即Fe₃O₄@BSA磁性納米顆粒；

步驟103、Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒的合成：將步驟102中得到的Fe₃O₄@BSA磁性納米顆粒分散在去離子水中，并加入PBS超聲分散，得到Fe₃O₄@BSA磁性納米顆粒分散液，然后將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽加入到Fe₃O₄@BSA磁性納米顆粒分散液中在避光條件下攪拌，繼續加入N-羥基琥珀酰亞胺在避光條件下攪拌，再加入RGD在室溫避光條件下攪拌進行反應，經磁分離、洗滌，得到RGD修飾的Fe₃O₄@BSA磁性納米顆粒即Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒；

步驟二、完整巨噬細胞膜包覆納米磁珠的制備

步驟201、將巨噬細胞接種于DMEM培養基中，放入恒溫培養箱中培養至細胞密度為70％～80％，棄去培養液后加入到含有步驟一中Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒的培養基中進行共培養，得到共培養液；

步驟202、采用胰酶消化步驟201中得到的共培養液，經磁分離收集負載Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒的細胞，將負載Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒的細胞重懸于含有Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒的培養基中得到細胞混懸液，然后將細胞混懸液吸入到電穿孔比色皿中并置于冰塊上孵育，再采用電穿孔儀進行電穿孔，并立即轉入冰浴中，加入預熱的培養基后放入培養箱中進行培養，經DMEM培養基洗滌后，得到負載Fe₃O₄@BSA-RGD磁性納米顆粒的巨噬細胞，即完整巨噬細胞膜包覆納米磁珠RAW-Fe₃O₄@BSA-RDG；

步驟三、垂釣中藥活性成分

步驟301、制備中藥提取物；

步驟302、將步驟二中制備的RAW-Fe₃O₄@BSA-RDG懸浮后得到懸浮液，然后將步驟301中制備的中藥提取物加入到懸浮液中，并放入培養箱中進行培養，再將培養液經磁力固液分離獲得沉淀，沉淀經緩沖液沖洗后采用有機溶劑振搖洗脫，經磁力固液分離得到含有中藥活性成分的垂釣液。

2.根據權利要求1所述的一種基于電穿孔的細胞膜包覆磁珠垂釣中藥活性成分的方法，其特征在于，步驟101中所述加熱回流采用的轉速為600rpm，溫度為200℃，時間為1h。