[發明專利]一種基于核酶-CRISPR的食品鉛污染檢測方法

在審

• 申請號: 202210171887.5
• 申請日: 2022-02-24
• 公開（公告）號: CN114480581A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 何強;劉玉梅;趙志峰;鄧銳杰;蔣瓊
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818;C12Q1/682;C12N15/113
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 鄧永紅

本發明公開了一種基于核酶?CRISPR的食品鉛污染檢測方法，利用核酶對鉛離子的高度選擇性及CRISPR相關蛋白Cas12a的反式切割活性的靈敏性對鉛離子進行高靈敏定性、定量分析。通過報告分子的熒光強度變化指示鉛離子的存在與否及濃度變化情況，將痕量鉛離子濃度信號轉化為熒光信號，提高檢測靈敏度，降低實驗檢出限。同時避免了核酸擴增帶來的假陽性問題。鉛離子作為核酶酶鏈的輔酶，可以激活酶鏈的酶切活性并高效地切割底物鏈，縮短反應時間，為食品、環境中的痕量鉛污染的快速檢測提供了可能。本發明是不依賴于擴增的一管混反應，不僅靈敏，同時簡化了實驗操作。本發明對向導RNA(gRNA)的序列、預引物的長度、dsDNA靶標的長度及核酶臂長進行了優化，檢出限為0.027nM。

技術領域

本發明涉及食品重金屬污染檢測領域，具體涉及一種基于核酶-CRISPR的食品鉛污染檢測方法。

背景技術

食品安全問題關乎公共衛生安全和人民生活質量。重金屬污染問題是食品安全問題的重要誘因。鉛離子由于其半衰期長、流動性強的特征，對人體健康有著潛在的長期威脅。研究表明，鉛對人體中樞神經系統、血液循環系統有明顯不良影響。飲食是人體攝入鉛的主要途徑，食品原料中的鉛含量一般較低，通過生物鏈富集進入人體危害人體健康。因此通過檢測食品原料中的痕量鉛，可以更好地控制鉛污染的食物鏈傳播途徑。功能核酸是在體外篩選的具有特異性識別功能的核酸序列，具有穩定性好、成本低等優勢。其中核酶以其獨特的催化活性和高度的特異性日益受到人們的廣泛關注，鉛離子核酶有DNAzyme 8-17及GR-5，研究表明GR-5對鉛離子具有更好的選擇性，因此本發明選擇GR-5來產生預引物。

規律間隔成簇短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)是原生細菌自帶的免疫系統，包括Cas9、Cas12a、Cas13a、Cas14a等功能蛋白。Cas蛋白本身并不具有特異性切割作用，在向導RNA(gRNA)及靶標雙鏈DNA(dsDNA)或單鏈DNA(ssDNA)的存在條件下，Cas蛋白-gRNA復合物對dsDNA或ssDNA的識別會激活Cas蛋白對靶標序列的切割活性，從而破壞外來入侵者的核酸序列，保護菌體安全。當gRNA存在時，gRNA與Cas12a蛋白形成復合物，此時Cas12a蛋白具有切割活性的結構域RuvC尚未打開，處于沉默狀態。在gRNA的指引下，Cas12a蛋白復合物識別PAM序列，此時gRNA與靶標序列(target strand)相結合，靶標序列互補鏈(Non-target strand)被置換下來，形成R-loop構型，這種構型的形成會加速RuvC結構域的暴露，激活Cas蛋白的順式切割活性(Cis-cleavage)及反式切割活性(Trans-cleavage)，值得注意的是，順式切割完成以后，殘留在Cas蛋白上的PAM末端仍能賦予Cas12蛋白反式切割活性，其對報告分子(Reporter)的非特異性切割在一定范圍內將鉛離子濃度信號轉換為熒光信號。

CN201710560469.4公開了一種用于畜禽飲用水中鉛離子檢測的復合材料修飾電極，其包括石墨烯修飾玻碳電極和通過電化學沉積法原位負載在所述石墨烯修飾玻碳電極表面的納米氧化鈷修飾層。該發明將石墨烯玻碳電極作為碳材料負載基底，采用電化學沉積法將納米氧化鈷粒子原位負載在還原態石墨烯層上，利用二價鈷離子與還原態石墨烯表面的含氧官能團發生鍵合作用，金屬鈷離子的納米顆粒充當成核位點，該結構有利于阻礙納米氧化鈷團聚，從而提高了該復合材料修飾電極的導電性和靈敏度。但是該設計原理復雜，同時檢出限較高，無法完成痕量鉛離子的檢測，因此無法從食物鏈初始端控制鉛污染。

發明內容

鑒于上述不足，本發明的目的在于提供一種十分靈敏、高效的基于核酶-CRIPSR的鉛離子檢測方法。通過繪制標準曲線確定該方法的檢出限、驗證其在實際樣品檢測中可行性，從而得到一種方便快速、更為精準的檢測鉛離子方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案。

一種基于核酶-CRIPSR的食品鉛污染檢測方法，包括如下步驟：