[發明專利]一種基于核酶-CRISPR的食品鉛污染檢測方法

在審

• 申請號: 202210171887.5
• 申請日: 2022-02-24
• 公開（公告）號: CN114480581A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 何強;劉玉梅;趙志峰;鄧銳杰;蔣瓊
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818;C12Q1/682;C12N15/113
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 鄧永紅

1.一種向導RNA(gRNA)轉錄溶液，包括：

100nM gRNA模板；

100nM T7啟動子；

1X Phi29緩沖液；

0.1U/μL Phi29 DNA聚合酶；

200nM dNTPs；

1X轉錄緩沖液；

0.1U/μL RNA聚合酶；

200nM rNTPs；

0.05U/μL DNase I(RNase-free)；

1X DNase Ibuffer；以及

分子生物水；

將上述溶液渦旋混勻后，置于金屬浴37℃條件下過夜轉錄。

2.根據權利要求1所述的向導RNA(gRNA)轉錄溶液，其中：

所述gRNA模板，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述T7啟動子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

所述Phi29緩沖液組成為60mM Tris-SO₄(pH9.0@25℃)，20mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，3％甘油和0.05％Tween-20；

所述Phi29 DNA聚合酶是人工純化的枯草芽孢桿菌噬菌體phi29(Φ29)的復制聚合酶；

所述dNTPs為脫氧核糖核酸A、T、C、G的混合溶液；

所述轉錄緩沖液組成為400mM Tris-HCl(25℃，pH 8.0)，200mM MgCl₂，25mM TCEP，20mMspermidine；

所述RNA聚合酶為一種依賴特異性DNA的RNA聚合酶，識別噬菌體的T7啟動子序列；

所述rNTPs為核糖核酸A、U、C、G的混合溶液；

所述DNase I(RNase-free)是一種降解雙鏈和單鏈DNA的DNA特異性核酸內切酶，降解產物為具有5'-磷酸和3'-OH的短寡核苷酸；

所述DNase Ibuffer組成為10mM Tris-HCl，2.5mM MgCl₂，0.5mM CaCl₂，pH 7.6@25℃

所述轉錄溶液用分子生物水補齊至40μL。

3.一種鉛離子待檢溶液，包括：

100nM GR5-18；

100nM GR7-7；

1X反應緩沖液；

1X逆轉錄反應緩沖液；

0.1U/μL T4 Polynucleotide Kinase；

1X Buf.klenow；

0.75mM dNTPs；

100nM模板；

0.1U/μL Klenow Fragment(3'-5'exo^-)；

1X NEBuffer^TM2.1；

100nM Lba Cas12a；

100nM gRNA；

500nM報告分子；

分子級生物水；以及

不同濃度鉛離子溶液；

將上述溶液渦旋混勻后置于PCR儀反應。