[發明專利]一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法

在審

• 申請號: 202210166790.5
• 申請日: 2022-02-23
• 公開（公告）號: CN114395614A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 徐君南;趙毅;孫蕾
• 申請（專利權）人: 遼寧康惠生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司 21208
• 代理人: 楊翠翠

一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法，其屬于生物技術領域。該方法包括體液病原微生物的提取及建庫的整個流程。提取過程所用的試劑包括蛋白酶K溶液、磁珠、裂解液、裂解結合液、一次洗滌液、二次洗滌液和洗脫液，建庫流程中所用的試劑包括末端修復酶、接頭試劑、pcr試劑。病原微生物提取過程中，優化了細胞裂解液、裂解結合液、一次洗滌液和二次洗滌液的配方，病原微生物建庫過程中優化了低樣本量建庫的實驗方法。本發明改善了體液宏基因組微生物檢測的實驗方法，縮短了檢測時間，為體液類樣本的測序奠定實驗基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及宏基因組病原微生物的提取及得到核酸提取物，并對其核酸進行文庫的構建，最終進行宏基因組測序。

背景技術

游離DNA(CirculatingfreeDNAorCellfreeDNA，cfDNA)，循環游離DNA或者細胞游離DNA，是釋放到血漿中的降解的DNA片段。cfDNA存在于人體的各種體液中，隨組織損傷、癌癥和炎癥反應等發生濃度變化。正常人體的cfDNA主要通過細胞凋亡過程中產生的小而均勻的185-200bp小片段DNA。在某些疾病和特殊狀態下，其他細胞也會釋放游離DNA入血，包括來源于腫瘤細胞的循環腫瘤DNA(ctDNA)和來源于胎兒的cfDNA等，導致產生大小不同且大于200bp的大片段DNA。血液不是可用于液體活檢的唯一體液，例如尿液、糞便、腦脊液(CSF)、唾液、胸水和腹水都是潛在來源，可從中獲得某些疾病或感染的核酸物質(包括cfDNA)。

游離核酸的提取成為檢測的關鍵步驟，傳統提取使用的試劑沉淀法需要用到酚，氯仿等存在一定的毒性的試劑，實驗過程中需要配置的試劑量多，存在較大的污染風險，且核酸提取濃度較低；常規的文庫檢測無法得知罕見病原，且對于片段長度的檢測存在一定局限，為后續的臨床檢測帶來難度。

近年來隨著高通量測序技術的不斷發展，尤其是新二代測序儀的出現，使宏基因組學發展尤為迅速。測序技術成本低、通量高、速度快，單次運行產出的數據量大，能夠同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序，測序片段較為廣泛，可以檢測臨床常規手段無法預知的病原微生物。

發明內容

為解決現有技術問題，本發明的目的是提供一種快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法。針對體液樣本建立高效的核酸提取方法，并對提取的核酸產物進行文庫的構建。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法，該方法中優化了細胞裂解液和洗滌液的配方，其中裂解液LSBuffer成分包括：乙二胺四乙酸的濃度為10-30mmol/L，氯化鈉的濃度為100-350mmol/L，曲拉通X-100的濃度為3-10％體積分數，異硫氰酸胍的濃度為1-8mol/L、5～8wt％Tween20。裂解結合液LBBuffer的成分包括：50-300g/L的異硫氰酸胍、2-8g/L的氯化鈉、體積占比20％-50％的曲拉通X-100、體積占比5％-40％的異丙醇、5-15g/L的檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷。洗滌液H1的成分包括：乙二胺四乙酸的濃度為5-100mmol/L，氯化鈉的濃度為100-300mmol/L，無水乙醇的濃度為20-60％體積分數，異丙醇的濃度為25％-80％體積分數，曲拉通X-100的濃度為2-5％體積分數；3～7mol/L鹽酸胍、1～10wt％Tween20。二次洗滌液H2的成分包括：75％的乙醇。洗脫液的成分包括：10～20mmol/LTris-Hcl和0.5～1.5mmol/LEDTA。

一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法，包括體液樣本中分離提取DNA，得到核酸提取物，并對其核酸進行文庫構建，最終進行宏基因組測序，得到所述樣本相關的宏基因組測序結果。其整個檢測步驟如下：

S1樣本前處理：將所得樣本進行離心處理，將上清轉移到15ml新的離心管中。