[發(fā)明專利]一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210166790.5
• 申請日: 2022-02-23
• 公開（公告）號: CN114395614A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐君南;趙毅;孫蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧康惠生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 大連星海專利事務(wù)所有限公司 21208
• 代理人: 楊翠翠

1.一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法，其特征在于：

從體液樣本中分離提取DNA得到核酸提取物；對其核酸進行文庫構(gòu)建，最終進行宏基因組測序，得到所述樣本相關(guān)的宏基因組測序結(jié)果；

S1.樣本前處理：將所得樣本進行離心處理，將上清轉(zhuǎn)移到離心管中；

S2.細(xì)胞裂解：向S1中的離心管中加入10-30ul的蛋白酶K溶液和裂解液LS Buffer，最大速度渦旋混勻；渦旋后的離心管放入恒溫水浴鍋中進行孵育20-40min；孵育后靜置10-15min；

所述裂解液LS Buffer中乙二胺四乙酸的濃度為10-30mmol/L，氯化鈉的濃度為100-350mmol/L，曲拉通X-100的濃度為3-10％體積分?jǐn)?shù)，異硫氰酸胍的濃度為1-8mol/L、Tween20的濃度為5～8wt％；

S3.微生物的裂解與結(jié)合：向S2的離心管中加入磁珠與裂解結(jié)合液LB Buffer,顛倒混勻，并于室溫連續(xù)混勻5-20min；將離心管置于磁力分離架上，室溫等待至溶液變得完全澄清，磁珠完全吸附于管內(nèi)一側(cè)；保持吸附狀態(tài)，小心吸除上清，吸除所有上清后，移除磁力分離架；

所述裂解結(jié)合液LB Buffer中包括50-300g/L的異硫氰酸胍、2-8g/L的氯化鈉、體積占比20％-50％的曲拉通X-100、體積占比5％-40％的異丙醇、5-15g/L的檸檬酸、10mM～50mM的三羥甲基氨基甲烷；

S4.一次洗滌：加入洗滌液H1，渦旋混勻3-7min；把離心管置于磁力分離架上，室溫等待至磁珠完全吸附于管內(nèi)一側(cè)；保持吸附狀態(tài)，吸除上清并移除磁力分離架；重復(fù)此步驟一次；

所述洗滌液H1中乙二胺四乙酸的濃度為5-100mmol/L，氯化鈉的濃度為100-300mmol/L，無水乙醇的濃度為20-60％體積分?jǐn)?shù)，異丙醇的濃度為25％-80％體積分?jǐn)?shù)，曲拉通X-100的濃度為2-5％體積分?jǐn)?shù)；鹽酸胍的濃度為3～7mol/L、Tween20的濃度為1～10wt％；

S5.二次洗滌：加入洗滌液H2，渦旋混勻3-7min；把離心管置于磁力分離架上，室溫等待至磁珠完全吸附于管內(nèi)一側(cè)；保持吸附狀態(tài)，吸除上清并移除磁力分離架；重復(fù)此步驟一次；

所述二次洗滌液H2的成分為75％的乙醇；

S6.干燥磁珠：把離心管置于磁力分離架上20-30min，以干燥磁珠；

S7.DNA洗脫：向離心管內(nèi)加入50-100ul洗脫液，渦旋充分重懸磁珠，室溫放置3-7min；

所述洗脫液中Tris-Hcl的濃度10～20mmol/L和EDTA的濃度為0.5～1.5mmol/L；

S8.DNA收集:把離心管置于磁力分離架上，室溫等待至溶液變得完全澄清，磁珠完全吸附于管內(nèi)一側(cè)；小心轉(zhuǎn)移上清DNA產(chǎn)物至離心管；

S9.濃度測定：用EQUALBIT DSDNA HS KIT試劑與Qubit儀器測定樣本DNA濃度；

S10.利用聚合酶對游離的DNA片段進行末端修復(fù)：5’端進行磷酸化和3’端加dA尾，得到DNA加A產(chǎn)物；5’端進行磷酸化的反應(yīng)條件為10-20℃，15-20min；3’端加dA尾的反應(yīng)條件為：55-65℃,15-20min；

S11.使用連接酶，將步驟S10中的DNA加A產(chǎn)物與DNA接頭連接在一起，得到含有接頭形式的DNA片段；

S12.將步驟S11得到DNA片段進行純化處理；

S13.將步驟S12純化后的DNA片段作為模板進行PCR擴增；PCR擴增反應(yīng)條件為95℃，3min；98℃，20s；60℃,15s；72℃，30s；72℃，5min，循環(huán)數(shù)依據(jù)建庫的數(shù)據(jù)量來決定；

S14.將步驟S13中PCR擴增后的產(chǎn)物進行分選；

S15.將步驟S14中分選后得到的產(chǎn)物進行純化，得到最終產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法，其特征在于：所述步驟S10中樣本提取濃度≦0.517ng/ul時，則向提取產(chǎn)物中引入外源基因進行建庫。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量快速檢測體液宏基因組病原微生物的方法，其特征在于：所述體液包括血液、尿液、胸腔引流液、腹腔引流液、腦脊液。