[發(fā)明專利]基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210165399.3
• 申請(qǐng)日: 2022-02-23
• 公開（公告）號(hào): CN114235772A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王旭東;王帥超;馮一鳴;呂全超;張漢君;李萌萌;干作飛;顧海濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京吉天儀器有限公司;杭州聚拓生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N21/53;G01N33/543;G01N33/58;G01N33/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供了基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法，所述基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法為：磁珠與待測(cè)樣品完成免疫反應(yīng)，之后在非牛頓溶液中重懸，重懸后的磁珠通入毛細(xì)管，在毛細(xì)管內(nèi)的流體流動(dòng)中，磁珠聚焦在毛細(xì)管的中心軸線；光源發(fā)出的檢測(cè)光照射毛細(xì)管內(nèi)依次通過(guò)的每個(gè)磁珠，獲得與每個(gè)磁珠對(duì)應(yīng)的前散射光信號(hào)和熒光信號(hào)，根據(jù)前散射信號(hào)獲得磁珠數(shù)量，根據(jù)所述熒光信號(hào)獲得與磁珠對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度A_i，i=1,2···N；根據(jù)磁珠數(shù)量和熒光強(qiáng)度得到陽(yáng)性磁珠比例f；比較比例f和閾值；若比例f小于所述閾值，選擇并利用數(shù)字檢測(cè)方法得出待測(cè)樣品濃度；若比例f不小于所述閾值，選擇并利用模擬檢測(cè)方法得出待測(cè)樣品濃度。本發(fā)明具有檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單分子檢測(cè)，特別涉及基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

低濃度蛋白生物標(biāo)志物的檢測(cè)在臨床的疾病診斷及疾病發(fā)展監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。當(dāng)前主要的蛋白檢測(cè)手段的靈敏度一般高于1 pM。但是，在腫瘤、神經(jīng)障礙和早期炎癥反應(yīng)等領(lǐng)域中，血清中的大部分重要蛋白指標(biāo)的濃度水平一般在0.1~1000 fM。比如，一個(gè)1 mm³體積的腫瘤包含1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞分泌5000個(gè)蛋白分子到5升循環(huán)血液中，最后的終濃度約為2×10^-15M（2fM）。所以高靈敏度的蛋白濃度檢測(cè)手段對(duì)于一些疾病的早期診斷和監(jiān)測(cè)具有重要意義。

蛋白單分子檢測(cè)方法用包被有捕獲抗體的磁珠捕獲抗原，再與帶有熒光/酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合。統(tǒng)計(jì)帶有標(biāo)記的陽(yáng)性磁珠占總磁珠的比例后，再通過(guò)泊松分布理論分析出樣本中目的蛋白的濃度。這種分析方法可以檢測(cè)極低濃度（1fg/mL）的樣品。由于這種分析方法是基于數(shù)字化的計(jì)算，而不是傳統(tǒng)ELISA的模擬算法，因此蛋白質(zhì)單分子檢測(cè)又稱為數(shù)字ELISA。

目前蛋白單分子檢測(cè)領(lǐng)域已有的設(shè)備和文獻(xiàn)采用了多種技術(shù)路線，大致可以分為以下兩種：

1. CCD拍照，蘇州宇測(cè)公司的的單分子檢測(cè)儀器采用的是CCD拍照方式。在儀器中，完成免疫反應(yīng)后的磁珠平鋪于流通池中，CCD相機(jī)對(duì)磁珠進(jìn)行明場(chǎng)拍照和熒光拍照。明場(chǎng)圖像用于分析磁珠數(shù)目及位置，熒光照片用于分析磁珠中帶有熒光標(biāo)記的比例。該方式的不足在于：CCD拍照方式分辨率低。

2.激光共聚焦，默克SMCxPRO的單分子檢測(cè)儀器采用的是激光共聚焦掃描方式。磁珠完成免疫反應(yīng)后，其表面結(jié)合的熒光物質(zhì)被洗脫下來(lái)進(jìn)入檢測(cè)池，激光共聚焦光斑對(duì)檢測(cè)池進(jìn)行掃描，分析其中熒光分子數(shù)目。該方式的不足在于：無(wú)法對(duì)磁珠進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)性大，靈敏度不足。

數(shù)字檢測(cè)原理為：當(dāng)檢測(cè)低濃度樣品時(shí)，較少的抗原隨機(jī)被較多的磁珠捕獲。大部分磁珠未捕獲到抗原或捕獲到1個(gè)抗原，小部分磁珠捕獲到2個(gè)或多個(gè)抗原。捕獲到特定個(gè)數(shù)抗原的磁珠所占比例符合泊松分布理論。數(shù)字檢測(cè)雖然檢測(cè)靈敏度很高，但是動(dòng)態(tài)范圍比較窄。當(dāng)樣品濃度較高時(shí)，陽(yáng)性磁珠所占比例會(huì)接近100%，測(cè)量誤差也會(huì)增大。所以對(duì)于高濃度樣品的檢測(cè)需要另外一種分析方法，即模擬（analog）算法。

Quanterix公司的Simoa單分子檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)高濃度樣品的時(shí)候用到了一種模擬檢測(cè)方法，結(jié)合數(shù)字檢測(cè)方法將檢測(cè)的動(dòng)態(tài)擴(kuò)大到4。該方法首先通過(guò)數(shù)字檢測(cè)確定單個(gè)抗原的熒光信號(hào)強(qiáng)度。但該模擬方法的不足在于：

1. 計(jì)算復(fù)雜，需要先經(jīng)過(guò)數(shù)字檢測(cè)確定單個(gè)抗原的熒光強(qiáng)度再通過(guò)模擬檢測(cè)計(jì)算抗原濃度。這樣可能會(huì)引入更多的誤差。

2. 多個(gè)抗原的熒光信號(hào)并不一定嚴(yán)格等于單個(gè)抗原的熒光信號(hào)與抗原個(gè)數(shù)的乘積。酶濃度與底物催化速率的非線性關(guān)系，高濃度熒光分子引起的抑制效應(yīng)以及探測(cè)器對(duì)不同光強(qiáng)的探測(cè)效率差異都可能導(dǎo)致誤差的增大。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)方案中的不足，本發(fā)明提供了一種基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法，所述基于聚焦技術(shù)的單分子檢測(cè)方法為：