[發(fā)明專利]一種檢測血液中p-tau181蛋白的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210163756.2
• 申請日: 2022-02-22
• 公開（公告）號: CN115015228A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉建芳;施維;杜為林;林杰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海科華生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/535;G01N33/68
• 代理公司: 上海世圓知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31320
• 代理人: 許俊東

1.一種檢測血液中p-tau181蛋白的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于包括：鏈霉親和素包被的磁微粒、生物素標(biāo)記的p-tau181抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的p-tau181抗體、p-tau181定標(biāo)品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的血液為血清或血漿。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的鏈霉親和素包被的磁微粒為甲苯磺酰基磁微粒、羧基磁微粒或者醛基磁微粒中的任意一種，粒徑為0.5-3um。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的生物素標(biāo)記的p-tau181抗體為識別p-tau181蛋白的單抗。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的p-tau181抗體為識別p-tau181蛋白的單抗。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的p-tau181定標(biāo)品為用定標(biāo)品緩沖液將p-tau181抗原配制成一系列濃度。

7.權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

鏈霉親和素包被磁珠的制備：

取甲苯磺酰基磁珠、羧基磁珠或者醛基磁珠，用MES緩沖液清洗磁珠，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，活化30min，活化后采用MES緩沖液清洗三次，加入鏈霉親和素，室溫下反應(yīng)16~24h，反應(yīng)后，封閉液清洗三次，加入封閉液，室溫反應(yīng)2h，封閉后，用緩沖液清洗三次，再用緩沖液把鏈霉親和素磁微粒稀釋到0.2mg/mL~0.8mg/mL作為R1；

MES緩沖液的濃度為10-100mM，pH5.5；

2）生物素標(biāo)記的p-tau181抗體的制備：

配制生物素溶液，識別p-tau181蛋白的抗體儲存溶液置換成PBS，在抗體溶液中加入配制好的生物素溶液，抗體：生物素的摩爾比為1:10~1:30，室溫反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，脫鹽柱去除未反應(yīng)的biotin，測試蛋白濃度，再用緩沖液把生物素標(biāo)記的p-tau181抗體稀釋到0.2-5ug/mL作為R2；

3）堿性磷酸酶標(biāo)記p-tau181抗體的制備：

識別p-tau181蛋白的抗體與活化劑1反應(yīng)30min，引入巰基；堿性磷酸酶與活化劑2反應(yīng)15min，引入馬來酰亞胺基團(tuán)；把帶有巰基的p-tau181抗體和帶有馬來酰亞胺基團(tuán)的堿性磷酸酶按照摩爾比為1:1混合，混合反應(yīng)16~24h，得到堿性磷酸酶標(biāo)記的p-tau181抗體，用緩沖液把堿性磷酸酶標(biāo)記p-tau181抗體稀釋到0.1ug/mL~3ug/mL，作為試劑R3；

活化劑1為 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、N-琥珀酰亞胺-S-乙酰巰基乙酸酯、2-巰基乙胺鹽酸鹽中的任意一種；

活化劑2為Sulfo-SMCC、 SM(PEG)12、 SM(PEG)24中的任意一種；

4）p-tau181定標(biāo)品的制備：

把p-tau181抗原用定標(biāo)品稀釋液配制成濃度為S1——0pg/mL , S2 —— 1.6pg/mL,S3——3.1pg/mL , S4 ——6.3pg/mL , S5——12.5pg/mL , S6——25pg/mL , S7——62.5pg/mL , S8——110pg/mL，分裝，-20℃保存。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的封閉液為BSA或者甘氨酸，pH7.0-7.6。