[發明專利]一種建立農桿菌介導中國水仙高效遺傳轉化體系的方法

有效

• 申請號: 202210162166.8
• 申請日: 2022-02-22
• 公開（公告）號: CN114410678B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 黃佳志;繆穎;任育軍
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/04
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 林文弘;蔡學俊

本發明公開了一種建立農桿菌介導中國水仙高效遺傳轉化體系的方法，包括以下步驟：植物材料預處理、外植體消毒、愈傷組織誘導、侵染液制備、農桿菌侵染、共培養和篩選培養以及GUS染色檢測。本發明以中國水仙子房為轉化材料，通過農桿菌類型和愈傷組織預培養時間及卡那霉素濃度的優化，建立了中國水仙的高效遺傳轉化體系，且轉化效率高，為中國水仙種植資源創制及品種改良奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域的中國水仙遺傳轉化方法，具體涉及一種誘導子房產生的愈傷組織為受體，建立農桿菌介導的中國水仙高效遺傳轉化體系的方法。

背景技術

中國水仙（Narcissus?tazetta?var.?chinensis）是石蒜科多年生球根植物，主要栽培區為福建漳州、上海崇明、浙江舟山，是中國傳統十大名花之一。其因花形態優美、花香淡雅、適應性強、易于雕刻等特點，頗具觀賞價值；但其花色單一，花期較短，限制了水仙花產業的發展。改良水仙花色和延長花期一直以來都是廣大園藝育種學家的重點研究目標之一。目前，國內外對中國水仙誘導愈傷組織體系的研究較為深入，但現有遺傳轉化體系受到基因型的限制多數只能瞬時表達，穩定遺傳轉化陽性率極低，因此，需要在前人的基礎上進行試驗摸索其適宜的遺傳轉化體系。

農桿菌Ti質粒可以攜帶外源基因通過同源重組插入植物基因組，且具有拷貝數固定、后代穩定遺傳簡單等優點。因此在植物轉基因方面，農桿菌介導法常被采用。中國水仙因其品種少，野生資源匱乏，同源三倍體有性雜交育種困難，因此通過基因工程，來改善花期、花色、花香、花形等性狀的育種手段可行性較強，應用價值高。目前有關建立高效中國水仙的遺傳轉化體系的研究普遍存在轉化效率低、不能穩定遺傳、再生能力差等問題。本發明擬解決上述問題，為進一步從中培育花期長、花香濃郁、花色豐富的水仙花新品種奠定基礎。

發明內容

針對已有技術的不足，本發明的目的在于提供一種建立農桿菌介導中國水仙高效遺傳轉化體系的方法。

為了實現上述目的，本發明采取如下技術解決方案：

一種建立農桿菌介導中國水仙高效遺傳轉化體系的方法，所述方法包括以下步驟：

（1）種球預處理：將三年生的中國水仙種球放置于4?℃避光冷藏4星期；

（2）外植體消毒：完整的花葶進行消毒處理后取出完整的子房；

（3）愈傷組織誘導：子房切成小塊，放置于Z1預培養培養基上，于溫度25±2?℃、光周期16?h/d、光照強度50?μmol?m^-2s^-1的條件下培養60d?；

（4）侵染液的制備：取2?μL?OD₆₀₀=0.8的單克隆農桿菌菌液轉接至2?mL?YEP液體培養基中，于28?℃、200?rpm振蕩培養36-48?h后取20μL菌液轉接至20?mL?YEP液體培養基中，于28?℃、200?rpm振蕩過夜培養直到OD₆₀₀達到0.8，離心收集菌體，并用1/2MS培養基沖洗菌體以除去殘余YEP液體培養基，再用含100?μM乙酰丁香酮的1/2MS培養基重懸菌體使得菌懸液OD₆₀₀達到0.4-0.5，菌懸液于140?rpm、28?℃條件下振蕩2-4?h，得到侵染液；

（5）侵染：將誘導得到的長勢良好的愈傷組織，浸沒到侵染液中，于室溫、20?0rpm條件下振蕩20?min；

（6）共培養：結束侵染后，取出愈傷組織鋪在無菌濾紙上，晾干后將愈傷組織夾到Z1液體培養基浸潤的濾紙上，28?℃黑暗共培養3?d；