[發(fā)明專利]一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)中國水仙高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202210162166.8 | 申請(qǐng)日： | 2022-02-22 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN114410678B | 公開（公告）日： | 2023-08-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 黃佳志;繆穎;任育軍 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 福建農(nóng)林大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/84 | 分類號(hào)： | C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/04 |
| 代理公司： | 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100 | 代理人： | 林文弘;蔡學(xué)俊 |
| 地址： | 350002 福*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 建立 桿菌 中國 水仙 高效 遺傳 轉(zhuǎn)化 體系 方法 | ||
1.一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)中國水仙高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：
（1）種球預(yù)處理：將三年生的中國水仙種球放置于4℃避光冷藏4星期；
（2）外植體消毒：完整的花葶進(jìn)行消毒處理后取出完整的子房；
（3）愈傷組織誘導(dǎo)：子房切成小塊，放置于Z1預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于溫度25±2℃、光周期16h/d、光照強(qiáng)度50μmol·m-2·s-1的條件下培養(yǎng)60d；
（4）侵染液的制備：取2μL?OD600=0.8的單克隆農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)接至2mL?YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)36-48h后取20μL菌液轉(zhuǎn)接至20mL?YEP液體培養(yǎng)基中，于28℃、200rpm振蕩過夜培養(yǎng)直到OD600達(dá)到0.8，離心收集菌體，并用1/2MS培養(yǎng)基沖洗菌體以除去殘余YEP液體培養(yǎng)基，再用含100μM乙酰丁香酮的1/2MS培養(yǎng)基重懸菌體使得菌懸液OD600達(dá)到0.4-0.5，菌懸液于140rpm、28℃條件下振蕩2-4h，得到侵染液；
（5）侵染：將誘導(dǎo)得到的長勢良好的愈傷組織，浸沒到侵染液中，于室溫、200rpm條件下振蕩20min；
（6）共培養(yǎng)：結(jié)束侵染后，取出愈傷組織鋪在無菌濾紙上，晾干后將愈傷組織夾到Z1液體培養(yǎng)基浸潤的濾紙上，28℃黑暗共培養(yǎng)3d；
（7）共培養(yǎng)結(jié)束與篩選：3d共培養(yǎng)結(jié)束后，用ddH2O沖洗愈傷組織5次，再用Z1液體培養(yǎng)基沖洗一次，鋪在無菌濾紙上晾干，再轉(zhuǎn)接至R1再生培養(yǎng)基于溫度25±2℃、光周期16h/d、光照強(qiáng)度50μmol·m-2·s-1的條件下培養(yǎng)30d，期間每20天繼代一次，得到抗性愈傷組織；
（8）得到的抗性愈傷組織采用GUS染色檢測，有藍(lán)色顯色反應(yīng)的抗性愈傷組織認(rèn)定為陽性愈傷組織，表明中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化成功；
其中，所述的消毒方法為：完整的花葶用1g/L的多菌靈溶液浸泡15min，再用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液浸泡1min，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的NaClO和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的Tween-20的混合溶液浸泡8min，再用無菌水沖洗5次，每次30s；
所述的Z1預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加了9mg/L的6-芐氨基嘌呤、3mg/L的1-萘乙酸、0.16g/L的硫酸腺嘌呤和30g/L的蔗糖；
所述的農(nóng)桿菌為EHA105農(nóng)桿菌，其含植物表達(dá)載體pGWB344，且攜帶有抗卡那霉素基因和報(bào)告基因GUS；
所述的Z1液體培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了400mg/L的頭孢霉素和50mg/L的卡那霉素；
所述的ddH2O中含有400mg/L的頭孢霉素和50mg/L的卡那霉素；
所述的YEP液體培養(yǎng)基中含有50mg/L的壯觀霉素及100mg/L的利福平；
所述的R1再生培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加了3mg/L的6-芐氨基嘌呤、9mg/L的1-萘乙酸、0.16g/L的硫酸腺嘌呤、30g/L的蔗糖以及50mg/L的卡那霉素。
2.如權(quán)利要求1所述的一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)中國水仙高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法在水仙育種中的應(yīng)用。
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