[發(fā)明專利]同步鑒別食品中多種動物源性成分的多重RT-PCR預(yù)混試劑凍干球及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210159959.4
• 申請日: 2022-02-22
• 公開（公告）號: CN114214434B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王守偉;韋憶萱;李家鵬;李金春;趙燕
• 申請（專利權(quán)）人: 中國肉類食品綜合研究中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了同步鑒別食品中多種動物源性成分的多重RT?PCR預(yù)混試劑凍干球及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的制備多重RT?PCR預(yù)混試劑凍干球的方法，其中，所述凍干球包括多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系和保護(hù)劑，所述多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系包含5對特異性引物組合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1?10所示，所述保護(hù)劑包括聚乙二醇8000、Triton X?100、甘露醇和海藻糖。本發(fā)明方法制備的多重RT?PCR凍干球，可常溫運輸和儲存，能用于鑒別肉或肉制品中是否含有豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉9種動物源性成分。具有檢測準(zhǔn)確，操作簡便快速高效的優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及同步鑒別食品中多種動物源性成分的多重RT-PCR預(yù)混試劑凍干球及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

由于肉類摻假的情況屢見不鮮，不僅侵害了消費者利益，也會對整個肉類產(chǎn)業(yè)造成巨大影響，因此需要可靠的肉類快速真?zhèn)舞b別技術(shù)，作為相關(guān)部門對肉類食品安全進(jìn)行監(jiān)管的重要檢測手段。

多重實時熒光PCR技術(shù)應(yīng)用在物種鑒別領(lǐng)域，具有特異性強(qiáng)、靈敏準(zhǔn)確、高通量和低成本的優(yōu)點。但由于實時熒光PCR反應(yīng)體系中的核心組分Taq酶的活性對溫度較為敏感，且熒光染料需要避光等諸多因素，因此這一類試劑在保存和運輸條件上的要求十分苛刻。液體狀態(tài)的試劑只能低溫避光保存以避免其性狀發(fā)生變化從而影響使用效果。其次，目前市面上應(yīng)用于物種檢測的熒光PCR產(chǎn)品多為各個組分獨立封裝的液體試劑盒形式，除了運輸和保存的弊端外，在使用時需要人工配制反應(yīng)液，操作繁瑣且增加了誤差和錯誤率。

液體試劑經(jīng)過冷凍干燥排除95%~99%的水分后，能夠有效延長保存期。但由于多重PCR反應(yīng)體系對酶穩(wěn)定性要求極其苛刻，使用常規(guī)的凍干保護(hù)劑和通用的冷凍干燥流程對多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行凍干后依舊會導(dǎo)致多個擴(kuò)增產(chǎn)物間比例發(fā)生巨大變化，致使檢測方法失去原有效果。因此，為將PCR反應(yīng)試劑在凍干過程中熱敏性酶發(fā)生變性或失活的幅度降到最低，且保證其他組分如引物、dNTP、熒光染料在凍干前后具有相同的效力，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有肉類鑒別技術(shù)的不足，提供一種可同步、快速鑒別肉或肉制品中豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉9種源性成分的多重?zé)晒釶CR預(yù)混試劑凍干球及其制備方法與應(yīng)用。

為了實現(xiàn)該目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種制備多重RT-PCR預(yù)混試劑凍干球的方法，所述凍干球包括多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系和保護(hù)劑，所述多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系包含5對特異性引物組合，其核苷酸序列如SEQID NO.1-10所示，所述保護(hù)劑包括聚乙二醇8000、Triton X-100、甘露醇和海藻糖。

本發(fā)明的凍干球含有以豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉的線粒體DNA為靶序列分別設(shè)計的5對特異性引物：羊F/羊R、牛F/牛R、狗狐貉F/狗狐貉R、豬F/豬R、雞鴨F/雞鴨R，其中，羊F/羊R可同時擴(kuò)增綿羊和山羊源性成分；狗狐貉F/狗狐貉R可同時擴(kuò)增狗源性、狐源性和貉源性成分；雞鴨F/雞鴨R可同時擴(kuò)增雞源性和鴨源性成分。應(yīng)用本發(fā)明提供的上述引物組合，以待測肉或肉制品的DNA為模板，使用多重?zé)晒釶CR方法進(jìn)行檢測時，各特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值具有顯著差異，可通過熔解曲線峰圖譜（峰的個數(shù)和Tm值）分析進(jìn)行鑒別。各特異性引物序列如下：

對綿羊、山羊源性成分?jǐn)U增時所需的特異性引物為：

羊F：5'- AACAAAGCGCCTTAAACCAATT -3'（SEQ ID NO.1）

羊R：5'-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT -3'（SEQ ID NO.2）；

對牛源性成分?jǐn)U增時所需的特異性引物為：

牛F：5'- GTTCTTCACGACACATACTACGTT -3'（SEQ ID NO.3）