[發明專利]同步鑒別食品中多種動物源性成分的多重RT-PCR預混試劑凍干球及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202210159959.4
• 申請日: 2022-02-22
• 公開（公告）號: CN114214434B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 王守偉;韋憶萱;李家鵬;李金春;趙燕
• 申請（專利權）人: 中國肉類食品綜合研究中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

1.一種制備多重RT-PCR預混試劑凍干球的方法，其特征在于，所述凍干球包括多重熒光PCR反應體系和保護劑，所述多重熒光PCR反應體系包含5對特異性引物組合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10所示；

所述保護劑由如下組分組成：20.1wt%聚乙二醇8000、1.8wt% Triton X-100、6.15wt%甘露醇、6.15wt%海藻糖，余量為水；

每20μL所述多重熒光PCR反應體系包含：SYBR Green Ⅰ Master預混液10μL，SEQ IDNO.1-2所示的引物各2.9pmol、SEQ ID NO.3-4所示的引物各4.35pmol、SEQ ID NO.5-6所示的引物各6.35pmol、SEQ ID NO.7-8所示的引物各2.4pmol、SEQ ID NO.9-10所示的引物各3.4pmol，其余體積用ddH₂O補足；

所述方法包括將所述多重熒光PCR反應體系與所述保護劑混合后，先滴入液氮再進行冷凍干燥的步驟；所述冷凍干燥的工藝順序依次為：預凍-40℃，0.5h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5h；-35℃，0.1mbar，2h；-30℃，0.1mbar，10h；0℃，0.1mbar，2h；20℃，0.05mbar，2h；終末干燥30℃，0.01mbar，3h；

所述多重熒光PCR反應體系與所述保護劑的體積比為1：0.2。

2.一種多重RT-PCR預混試劑凍干球，其特征在于，通過權利要求1所述的方法制備得到。

3.權利要求2所述的凍干球在同步鑒別肉或肉制品中多種動物源性成分中的應用，所述動物源性成分為豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐和貉。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，應用時，以待測肉或肉制品的DNA和復溶后的所述凍干球的混合物為待測物，使用RT-PCR方法進行檢測，以熒光信號對溫度的一階負導數為縱坐標，溫度為橫坐標，得到熔解曲線峰值圖，根據熔解曲線峰值圖中峰的個數和位置判定結果；

每一種特異性擴增產物峰代表一種特定的動物源性成分，其中，Tm值在71.1~73.7 ℃范圍內出現的熔解曲線峰為綿羊或山羊源性成分檢出；Tm值在74.0~75.4 ℃范圍內出現的熔解曲線峰為牛源性成分檢出；Tm值在76.2~78.1 ℃范圍內出現的熔解曲線峰為狗或狐貍或貉源性成分檢出；Tm值在80.3~81.2 ℃范圍內出現的熔解曲線峰為豬源性成分檢出；Tm值在84.7~87.5 ℃范圍內出現的熔解曲線峰為雞或鴨源性成分檢出。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，RT-PCR反應條件為：（1）預變性：95℃，5min；（2）變性：95℃，15 s； 退火+延伸：57℃，45 s，30個循環；（3）熔解曲線：95℃，1min；70℃，1min；以0.02℃/s速率升溫至95℃，同時連續檢測熒光強度；降溫至40℃，1min。