[發(fā)明專利]一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚-O-甲基轉移酶的方法

在審

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• 申請日: 2022-02-21
• 公開（公告）號: CN114317482A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設計）人: 張春鴿;徐延偉;趙巧輝;岳試超;姜婷婷;李桂林;付光宇;楊增利
• 申請（專利權）人: 鄭州伊美諾生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/48
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 張雪嬌

本發(fā)明提供了一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚?O?甲基轉移酶的方法，包括：S1)將新鮮豬肝進行組織破碎后，加入細胞裂解液進行浸提，離心，得到浸提液；S2)調(diào)節(jié)所述浸提液的pH值至酸性進行酸處理后，離心，得到上清液；S3)將所述上清液調(diào)節(jié)至中性或弱堿性后，進行硫酸銨分級沉淀，得到粗蛋白；S4)將所述粗蛋白復溶后經(jīng)中空纖維過濾濃縮，得到濃縮液；S5)將所述濃縮液經(jīng)離子交換層析純化，得到兒茶酚?O?甲基轉移酶。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的方法可規(guī)模化制備，成本較低，且得到的兒茶酚?O?甲基轉移酶純度高。

技術領域

本發(fā)明屬于生物行業(yè)及醫(yī)學檢測技術領域，尤其涉及一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚-O-甲基轉移酶的方法。

背景技術

兒茶酚胺是腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺的總稱，主要由交感神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)產(chǎn)生和釋放。腎上腺髓質(zhì)主要產(chǎn)生腎上腺素和少量的去甲腎上腺素，交感神經(jīng)主要分泌去甲腎上腺素，兩者在單胺氧化酶(MAO)和兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)作用下通過兩種不同代謝途徑最終生成3-甲氧-4-羥苦杏仁酸(VMA，又稱香草酸)，與葡萄糖醛酸或硫酸結合成酯類從尿中排出，在病理情況下，特別是嗜鉻組織的腫瘤，分泌產(chǎn)生大量腎上腺素和去甲腎上腺素，引起血壓升高。

COMT以膜結合型和分泌型2種形式在哺乳動物多種組織中廣泛存在，其主要功能發(fā)揮在多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分解代謝中，其作用機制為將甲基供體上的甲基轉移至兒茶酚胺的3位和4位羥基上，從而使兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)失活。因此COMT在醫(yī)學檢驗領域作用重要，特別在開發(fā)兒茶酚胺檢測試劑盒研究中，而且目前國內(nèi)尚無規(guī)模化提取方式。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚-O-甲基轉移酶的方法。

本發(fā)明提供了一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚-O-甲基轉移酶的方法，包括：

S1)將新鮮豬肝進行組織破碎后，加入細胞裂解液進行浸提，離心，得到浸提液；

S2)調(diào)節(jié)所述浸提液的pH值至酸性進行酸處理后，離心，得到上清液；

S3)將所述上清液調(diào)節(jié)至中性或弱堿性后，進行硫酸銨分級沉淀，得到粗蛋白；

S4)將所述粗蛋白復溶后經(jīng)中空纖維過濾濃縮，得到濃縮液；

S5)將所述濃縮液經(jīng)離子交換層析純化，得到兒茶酚-O-甲基轉移酶。

優(yōu)選的，所述細胞裂解液包括緩沖液、還原性谷胱甘肽、金屬螯合劑與蛋白酶抑制劑；所述細胞裂解液的pH值為6.5～8；所述細胞裂解液中還原性谷胱甘肽的濃度為5～15mmol/L；所述細胞裂解液中金屬螯合劑的濃度為0.5～3mmol/L；所述細胞裂解液中蛋白酶抑制劑的濃度為0.5～3mmol/L。

優(yōu)選的，所述緩沖液為PBS緩沖液或Tris緩沖液；所述金屬螯合劑為乙二胺四乙酸；所述蛋白酶抑制劑為苯甲基磺酰氟。

優(yōu)選的，所述浸提的溫度為2℃～8℃；所述浸提的時間為4～12h；所述離心在低溫條件下進行；所述離心的轉速為8000～15000rpm；所述離心的時間為10～50min。

優(yōu)選的，所述步驟S2)中調(diào)節(jié)所述浸提液的pH值至4.5～5.5；所述酸處理的溫度為2℃～8℃；所述酸處理的時間為10～50min。

優(yōu)選的，所述步驟S3)中采用堿金屬氫氧化物溶液調(diào)節(jié)所述上清液的pH值；將所述上清液調(diào)節(jié)至pH值為7～7.4。

優(yōu)選的，所述步驟S3)中硫酸銨分級沉淀為兩級硫酸銨沉淀，具體為：添加硫酸銨至其質(zhì)量濃度為25％～35％，收集上清，然后在上清中添加硫酸銨至其質(zhì)量濃度為50％～60％，收集沉淀，得到粗蛋白。

優(yōu)選的，所述步驟S4)具體為：