[發明專利]一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚-O-甲基轉移酶的方法

在審

• 申請號: 202210156880.6
• 申請日: 2022-02-21
• 公開（公告）號: CN114317482A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 張春鴿;徐延偉;趙巧輝;岳試超;姜婷婷;李桂林;付光宇;楊增利
• 申請（專利權）人: 鄭州伊美諾生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/48
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張雪嬌

1.一種從新鮮豬肝中提取兒茶酚-O-甲基轉移酶的方法，其特征在于，包括：

S1)將新鮮豬肝進行組織破碎后，加入細胞裂解液進行浸提，離心，得到浸提液；

S2)調節所述浸提液的pH值至酸性進行酸處理后，離心，得到上清液；

S3)將所述上清液調節至中性或弱堿性后，進行硫酸銨分級沉淀，得到粗蛋白；

S4)將所述粗蛋白復溶后經中空纖維過濾濃縮，得到濃縮液；

S5)將所述濃縮液經離子交換層析純化，得到兒茶酚-O-甲基轉移酶。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞裂解液包括緩沖液、還原性谷胱甘肽、金屬螯合劑與蛋白酶抑制劑；所述細胞裂解液的pH值為6.5～8；所述細胞裂解液中還原性谷胱甘肽的濃度為5～15mmol/L；所述細胞裂解液中金屬螯合劑的濃度為0.5～3mmol/L；所述細胞裂解液中蛋白酶抑制劑的濃度為0.5～3mmol/L。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為PBS緩沖液或Tris緩沖液；所述金屬螯合劑為乙二胺四乙酸；所述蛋白酶抑制劑為苯甲基磺酰氟。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸提的溫度為2℃～8℃；所述浸提的時間為4～24h；所述離心在低溫條件下進行；所述離心的轉速為8000～15000rpm；所述離心的時間為10～50min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2)中調節所述浸提液的pH值至4.5～5.5；所述酸處理的溫度為2℃～8℃；所述酸處理的時間為10～50min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3)中采用堿金屬氫氧化物溶液調節所述上清液的pH值；將所述上清液調節至pH值為7～7.4。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3)中硫酸銨分級沉淀為兩級硫酸銨沉淀，具體為：添加硫酸銨至其質量濃度為25％～35％，收集上清，然后在上清中添加硫酸銨至其質量濃度為50％～60％，收集沉淀，得到粗蛋白。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S4)具體為：

將所述粗蛋白用緩沖液復溶后，依次用500～750KD中空纖維、100～300KD中空纖維與10～30KD中空纖維濃縮，得到濃縮液。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述離子交換層析所用的填料為陰離子交換填料；所述離子交換層析所用的洗脫緩沖液為PB緩沖液與氯化鈉水溶液；所述PB緩沖液的濃度為0.01～0.05mol/L；所述氯化鈉水溶液的濃度為0.5～2mol/L；所述離子交換層析為洗脫緩沖液鹽濃度逐步增加的階梯梯度洗脫。

10.權利要求1～9任意一項方法所提取的兒茶酚-O-甲基轉移酶在制備兒茶酚胺檢測試劑盒中的應用。