[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的鴯鹋雛鳥(niǎo)性別鑒定方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202210156093.1 | 申請(qǐng)日： | 2022-02-21 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN114292926B | 公開(kāi)（公告）日： | 2023-09-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張曉愛(ài);于躍江;曹婉怡;陳莊;張鐵軍;魏文康;彭長(zhǎng)祿;王志林 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心;廣東新基鴯鹋實(shí)業(yè)有限公司 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12Q1/6888 | 分類(lèi)號(hào)： | C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京眾達(dá)德權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11570 | 代理人： | 張曉冬 |
| 地址： | 510640 廣*** | 國(guó)省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 準(zhǔn)確 鴯鹋 雛鳥(niǎo) 性別 鑒定 方法 | ||
1.一種快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的鴯鹋雛鳥(niǎo)性別鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：
S1：在鴯鹋養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)鴯鹋雛鳥(niǎo)佩戴好標(biāo)有編號(hào)的腳環(huán)標(biāo)記，然后進(jìn)行采樣，采取幼鳥(niǎo)背部和尾部羽毛各5根，放入低溫冷藏盒送往檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室；
S2：將2根羽毛的根部0.5cm處剪下，然后剪碎放入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中，加入20μl的20mg/ml蛋白酶K，立刻渦旋振蕩充分混勻，從而得到裂解物；
S3：將裂解物放置在55℃水浴過(guò)夜直到組織消化完全，然后加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘，待其自然冷卻后加入100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，得到混合物；
S4：用1ml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，將吸附柱放入收集管中以13000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，加入200μl抑制物去除液IR，以12000rpm離心30秒，倒掉廢液，加入700μl漂洗液WB，以12000rpm離心30秒，倒掉廢液，加入500μl漂洗液WB，以12000rpm離心30秒，倒掉廢液；
S5：將吸附柱AC放回空收集管中，以13000rpm離心2分鐘，去除漂洗液，然后取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩沖液EB，室溫放置3-5分鐘；
S6：然后以12,000rpm離心1分鐘，然后丟棄吸附柱AC，保留含DNA溶液的離心管，用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)?DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，從而得到提取的基因組DNA，對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行保存；
S7：根據(jù)鴯鹋Z和W染色體的差異短序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物來(lái)區(qū)分雌雄，所述兩對(duì)引物由一條共用的上游引物Emu-SD1、兩條下游引物Emu-SD2和Emu-SD3組成，引物Emu-SD2對(duì)應(yīng)的區(qū)域僅存在于W染色體上，為雌性鴯鹋所特有，然后在引物Emu-SD2區(qū)域的上游和下游各選取了一個(gè)Z、W序列相同區(qū)作為引物Emu-SD1和引物Emu-SD3的設(shè)計(jì)區(qū)，所設(shè)計(jì)的引物Emu-SD1的序列為AGCTGCTTTGCTACTGCTTTATCCT，引物Emu-SD2的序列為AATGAGTGTCTCAGTACTCCTTTG，引物Emu-SD3的序列為T(mén)AGGAATTAATTACTCAGGTAAAAC；
S8：然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR?反應(yīng)體系共50μl，所述反應(yīng)體系如下：
鴯鹋基因組DNA?1μl
10μM?Emu-SD1、2和3?各?1μl
2x?EasyTaq?PCR?SuperMix?25μl
H2O?21μl
PCR?反應(yīng)條件如下：
①預(yù)變性：?94℃?5min
②變性：?94℃?30s
③退火：?51℃?30s
④延伸：?72℃?40s
⑤終延伸：?72℃?10min
且②-④循環(huán)?35?次；
S9：將PCR?擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，0.5×TBE電泳緩沖液，150V，電泳40min，DNA染料為NA-Red?，紫外下拍照后將電泳條帶與DL2000?DNA?ladder對(duì)比，出現(xiàn)165bp雌性特異性條帶的為雌性鴯鹋；缺少165bp雌性特異性條帶，且出現(xiàn)1條408bp的擴(kuò)增條帶，為雄性鴯鹋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的鴯鹋雛鳥(niǎo)性別鑒定方法，其特征在于：所述步驟S1中采樣時(shí)，采樣者需要穿戴一次性手套拔取每只鴯鹋幼鳥(niǎo)背部和尾部羽毛各5根，每次拔羽后，需要使用手套翻轉(zhuǎn)包裹羽毛，用夾子夾緊手套，然后將羽毛連同手套放入低溫冷藏盒內(nèi)進(jìn)行存放。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的鴯鹋雛鳥(niǎo)性別鑒定方法，其特征在于：所述步驟S5中洗脫緩沖液在使用前，放入65-70℃的水中進(jìn)行預(yù)熱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的鴯鹋雛鳥(niǎo)性別鑒定方法，其特征在于：所述步驟S6中使用到的核酸蛋白測(cè)定儀為美國(guó)Nanodrop?ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的鴯鹋雛鳥(niǎo)性別鑒定方法，其特征在于：所述步驟S6中提取到的基因組DNA需要在-20℃下進(jìn)行保存。
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