[發明專利]基于雙功能融合蛋白的真菌毒素磁化學發光免疫分析試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202210155141.5
• 申請日: 2022-02-21
• 公開（公告）號: CN114594262B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 王松雪;劉洪美;葉金;倪保霞;陳金男
• 申請（專利權）人: 國家糧食和物資儲備局科學研究院
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/543;G01N33/53;C07K19/00;C12N9/16;C12N15/70;C12N15/62
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

1.一種真菌毒素磁化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括鏈霉親和素磁微粒、生物素標記的真菌毒素抗原、真菌毒素標準品溶液、真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白、樣本稀釋液、洗滌液、底物液；

所述真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白是以堿性磷酸酶作為生物發光的催化劑，將真菌毒素納米抗體與堿性磷酸酶融合表達獲得；所述真菌毒素納米抗體選自駱駝科或鯊魚科動物的重鏈抗體；

所述真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如以下中的任一種或多種：

黃曲霉毒素B1納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；

玉米赤霉烯酮納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

T-2毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

伏馬毒素B1納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

赭曲霉毒素A納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白是通過下述方法制備的：

(1)真菌毒素納米抗體基因的設計與合成：根據真菌毒素納米抗體的氨基酸序列，通過優化基因的結構實現基因在大腸桿菌中的高效表達，包括使用大腸桿菌偏愛密碼子，消除可能存在的二級結構，使GC/AT均衡，設計并合成真菌毒素納米抗體基因的核苷酸片段；

(2)真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合表達載體的構建：將步驟(1)合成的真菌毒素納米抗體基因與堿性磷酸酶基因克隆到原核表達載體中，構建真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合表達載體；

(3)真菌毒素納米抗體-堿性磷酸酶雙功能融合蛋白的表達：將雙功能融合表達載體轉化至表達菌株E.coli BL21或Rosetta DE3的感受態細胞中，誘導表達，收集菌體細胞，加入菌體蛋白提取試劑，離心收集含有可溶性蛋白的上清液；

(4)雙功能融合蛋白的純化：采用Ni²⁺-NTA親和層析柱進行融合蛋白的純化。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁微粒是以四氧化三鐵或三氧化二鐵超順磁性材料為內核，外圍包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通過物理或化學的方法活化使磁微粒表面產生氨基、甲苯磺?；Ⅳ然颦h氧基基團，粒徑為1-2μm。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈霉親和素磁微粒是將鏈霉親和素與磁微粒偶聯。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的真菌毒素抗原是先將真菌毒素和牛血清白蛋白偶聯，再將得到的牛血清白蛋白-真菌毒素復合物和生物素偶聯。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述真菌毒素標準品溶液是將真菌毒素標準品溶于甲醇-水混合溶液中配制而成。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述甲醇-水混合溶液中，甲醇與水的體積比為20:80-80:20。

8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底物液是濃度為0.5-2mmol/L的(4-氯苯巰基)(10-甲基-9,10-二氫化吖啶亞甲基)磷酸二鈉鹽溶液。

9.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述樣本稀釋液由0.01M磷酸鹽緩沖液、0.1％吐溫20和0.5％牛血清白蛋白組成。

10.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液由0.01MTris-HCl緩沖液和0.1％吐溫20組成。