[發明專利]一種利用單加氧酶ycnE降解吲哚和/或吲哚酮產生靛紅的方法

在審

• 申請號: 202210153248.6
• 申請日: 2022-02-18
• 公開（公告）號: CN114438148A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 鄧俊勁;李家洲;陳紅萍;劉淑揚
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物科學研究所
• 主分類號: C12P17/10
• 分類號: C12P17/10;C12N9/02
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發明公開了一種利用單加氧酶ycnE降解吲哚和/或吲哚酮產生靛紅的方法。本發明采用基因工程的技術方法獲得抗生素生物合成單加氧酶基因ycnE，并構建重組質粒，然后在大腸桿菌中誘導表達，通過親和層析對細胞破碎液中的抗生素生物合成單加氧酶ycnE組分進行純化，首次成功表達并純化了ycnE，并通過該酶首次實現使用酶催化法轉化吲哚和/或吲哚酮產生靛紅，降解率達25％，表現出良好的應用潛力。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種利用單加氧酶ycnE降解吲哚和/或吲哚酮產生靛紅的方法。

背景技術

吲哚又名苯并吡咯，是一種由苯環和吡咯環并聯形成的氮雜環芳香族化合物。吲哚在低濃度時具有花香味，而在濃度高時則具有強烈臭味，是臭味產生的主要原因之一。在吲哚-3-甘油磷酸酯和色氨酸存在的情況下，植物和微生物可以通過色氨酸酶或其類似物產生吲哚，因此吲哚存在于植物和富含細菌的生態位中，如土壤、根際、污泥和腸道等。動物本身不能合成吲哚，但很多動物共生菌尤其是腸道微生物可以轉化色氨酸合成吲哚，吲哚通過汗液、尿液和糞便等排泄物排出體外。此外，在煤焦油、動物糞便和污水中都發現了相對較高濃度的吲哚，這是造成氣味污染的主要原因。隨著煤礦、石油加工和動物集約化養殖的發展，大量含吲哚的廢水和煙霧產生并排放到環境中，導致了嚴重的環境污染和臭味滋擾。

吲哚由于其毒性和潛在的致突變性，長期以來被認為是廢水中典型的雜環芳烴污染物。據報道高濃度的吲哚會引發動物臟腑和組織的出血和充血、貧血、白血球異常、溶血病、血紅蛋白腎病、暫時性皮膚刺激、腫瘤形成和植物色素沉著減少等問題。對于微生物，高濃度的吲哚會造成細胞膜氧化毒性，通過影響膜電位而阻止細胞分裂，抑制三磷酸腺苷的產生和蛋白質折疊，并導致DNA損傷。

吲哚是一類難以根除的有毒環境污染物，研究開發合適的、沒有環境污染的生物酶法降解的處理方法，是一個具有重大生態價值與理論價值的研究課題。目前對于吲哚類化合物的去除主要有物理化學法和生物法。物理化學法，包括超聲波法、臭氧氧化等，雖然物理化學法具有較好的吲哚去除效率，但是運行費用高、能耗大，且會產生毒性更大的持久性有機污染物。而微生物轉化在吲哚污染系統修復中具有高效、價廉且環境友好的特點，被廣泛用于環境污染物的處理中。目前關于微生物降解轉化吲哚的研究多集中于群落分析、產物鑒定和途徑解析中，而對于吲哚降解的功能基因研究較少。篩選出高效降解吲哚的功能基因、產酶量高且適合工業化生產的菌株及表達系統、尋找合適的發酵工藝、探索使酶活穩定的方法等是推動吲哚降解研究及相關產業發展的重要研究方向。

目前尚無商品化的吲哚降解酶，對于吲哚降解相關的功能基因研究也較少。Guang-Huey Lin等用E.coli CY15000重組表達Acinetobacter baumannii的IacA可在5μM酶濃度下可轉化吲哚為靛藍；Mikas Sadauskas等用E.coli BL21(DE3)重組表達Acinetobacter sp.Strain O153的IifC可在IifD存在下轉化吲哚為靛藍；Yuanyuan Qu等用E.coli BL21(DE3)重組表達Cupriavidus sp.SHE的IndA可轉化吲哚為靛藍；Qiao Ma等用E.coli BL21(DE3)重組表達Burkholderia sp.IDO3的IifCD，重組大腸桿菌可以轉化吲哚為靛藍。與本發明重組表達的抗生素生物合成單加氧酶ycnE相似的序列無功能驗證、重組表達、相關降解活性等分析。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種利用單加氧酶ycnE降解吲哚和/或吲哚酮產生靛紅的方法。本發明采用基因工程的技術方法得抗生素生物合成單加氧酶基因ycnE，并構建重組質粒，然后在大腸桿菌中誘導表達，通過親和層析對細胞破碎液中的抗生素生物合成單加氧酶ycnE組分進行純化，首次成功表達并純化了ycnE，并首次證明該酶能轉化吲哚為靛紅。本發明首次異源表達的抗生素生物合成單加氧酶ycnE具有吲哚降解活性，而且可以降解吲哚生成靛紅，與同類報道的轉化產物靛藍有明顯差異。

本發明的目的通過下述技術方案實現：