[發明專利]一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法

在審

• 申請號: 202210150261.6
• 申請日: 2022-02-18
• 公開（公告）號: CN114527281A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 王杰文
• 申請（專利權）人: 深圳中檢聯檢測有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/543;G01N33/577;G01N33/531;G01N33/53;C07K16/44
• 代理公司: 深圳市精英創新知識產權代理有限公司 44740
• 代理人: 林燕云

1.一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)鉛離子完全抗原的制備：取4.5～10.0mg重量份載體蛋白、0.8～1.8mg重量份雙功能鰲合劑、0.7～0.8mg重量份Pb(NO₃)₂及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1～3ml體積份的HEPES緩沖溶液中溶解，15～30℃溫度下振蕩8～24h后，用超濾或透析的方法去除未反應的低分子物質，剩余物于HEPES緩沖溶液中保存，分裝，得到鉛離子完全抗原；

(2)包被好完全抗原并封閉的ELISA酶標板的制備：將步驟(1)所得的鉛離子完全抗原包被于酶標板微孔內,鉛離子完全抗原的加入量為100ng/well；接著用質量百分比為3％的BSA封閉，在37℃孵育1～5h，于吸水紙上拍干，用PBST溶液洗滌3次得到包被好完全抗原并封閉的ELISA酶標板。其中PBST的制備是由0.01M、pH值為7.4的PBS緩沖液與Tween-20按體積比1000:0.5混合得到；

(3)免疫學檢測：將鉛離子完全抗原包被于酶標板微孔內，接著封閉，再加入待檢樣品，于37℃反應至少5min，PBST溶液洗滌，再加入抗鉛單克隆抗體，每孔加入100～500ng，于37℃孵育至少30min；再用PBST溶液洗滌，加入酶標記的羊抗鼠IgG，加入量為每孔10～14.5ng/we1l，于37℃孵育至少30min后用PBST溶液洗滌，再加入底物進行顯色反應，根據顯色的深淺對樣品中鉛離子含量進行定性和半定量分析。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：所述的抗鉛單克隆抗體的制備包括以下步驟：將包被鉛離子完全抗原注入到Balb/c小鼠體內，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔；利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌鉛單克隆抗體的雜交瘤細胞株；注射細胞進小鼠體內誘生腹水；將采集的腹水用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20℃保存。

3.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：所述載體蛋白、雙功能鰲合劑、Pb(NO₃)₂及三乙胺的重量比為(4～8)：(0.7～1.2)：(0.4～0.7)：(2.5～4.0)。

4.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：所述載體蛋白、雙功能鰲合劑、Pb(NO₃)₂及三乙胺的重量比為5：0.9：0.6：3。

5.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：所述的底物為TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)顯色底物，使用濃度優選為100～150u g/mL。

6.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：步驟(1)中的震蕩溫度為16～30℃，振蕩時間為9～24h。

7.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：步驟(2)中孵育時間為1～4h。

8.根據權利要求1所述的一種快速檢測糧食中重金屬鉛離子的免疫學方法，其特征在于：步驟(3)中酶標記的羊抗鼠IgG加入量為每孔10～12.5ng/we1l。