[發明專利]一種CAR細胞療法用核酸構建體及其慢病毒載體、細胞制劑和應用

在審

• 申請號: 202210148733.4
• 申請日: 2022-02-18
• 公開（公告）號: CN114891115A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 陳偉;劉昊
• 申請（專利權）人: 杭州美中疾病基因研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州中利知識產權代理事務所(普通合伙) 33301
• 代理人: 肖洋

本發明公開了一種CAR細胞療法用核酸構建體及其慢病毒載體、細胞制劑和應用，其中，一種CAR細胞療法用核酸構建體，包括依次串連的信號肽、抗原結合區、胞外鉸鏈區、跨膜結構域和胞內信號域，所述胞內信號域由DAP10CD、CD137CD和CD3ζSD所組成。一種慢病毒載體，包含CAR細胞療法用核酸構建體的基因。一種細胞制劑，為導入有前述慢病毒載體的免疫效應細胞。一種細胞制劑在癌癥治療中的應用。本發明所制備出的細胞制劑相較于其他CAR結構構建的免疫細胞制劑具有較高的活性，尤其該類CAR結構修飾的NK細胞，對表達目標靶點腫瘤細胞(如表達Her?2的乳腺癌細胞)具有極高的殺傷能力。

【技術領域】

本發明涉及細胞免疫治療的技術領域，特別是一種CAR細胞療法用核酸構建體及其慢病毒載體、細胞制劑和應用的技術領域。

【背景技術】

惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一。傳統的腫瘤治療方式，如手術、放療和化療，是近幾十年來用于腫瘤治療的主要策略。但是，病人容易對藥物和放療治療產生抗性，致使高頻率的腫瘤復發。近年來，腫瘤細胞治療因其靶向性、效果顯著和幾無副作用等優點得到了極大關注，逐步成為腫瘤綜合治療中的一個重要手段，被業界稱為腫瘤的綠色療法，也是當前腫瘤治療基礎研究和臨床應用的熱點與發展方向。

腫瘤的嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor,CAR)療法，指一種用嵌合抗原受體修飾的免疫細胞治療腫瘤的新型精準靶向療法，近幾年通過優化改良在臨床腫瘤治療上取得了很好的效果，具有精準、快速和高效的特點，有可能治愈癌癥，非常有前景。在通常情況下，腫瘤的嵌合抗原受體細胞療法通過基因工程技術，將識別腫瘤的定位導航裝置嵌合抗原受體轉導入免疫細胞(如T細胞和NK細胞)，對應地重組為CAR-T細胞和CAR-NK細胞。CAR-T細胞和CAR-NK細胞能夠利用其轉導的CAR結構，專門識別體內腫瘤細胞后獲得激活，通過免疫作用釋放大量的多種效應因子，從而高效地殺滅腫瘤細胞，達到治療惡性腫瘤的目的。

嵌合抗原受體通常由腫瘤相關抗原結合區、胞外鉸鏈區、跨膜結構域以及包含或不包含共刺激結構域的細胞內信號傳導結構域序貫串聯組成。隨著科學技術研究的持續推進，CARs至今已經發展到了第四代。其中，第一代CARs包含胞外單鏈可變片段scFv、跨膜區和單個胞內激活信號CD3ζ或FcεRIγ。第一代CAR-T細胞只能引起短暫的T細胞增殖和較少的細胞因子分泌，其體內抗腫瘤活性受到極大限制，并且T細胞增殖減少最終會導致T細胞的凋亡。第二代CARs在第一代CARs的基礎上引入了一個共刺激分子，提高了腫瘤殺傷效力。在第三代CARs中，則搭載了多個共刺激因子，如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等。共刺激分子可以激活T細胞內的JNK、ERK和NF-κB等信號通路，使T細胞在抗腫瘤活性、增殖活性、存活周期和細胞因子(如IL-2、TNF-α和IFN-γ)的分泌延長等方面均產生顯著提高。第四代CARs在第三代CARs的基礎上增加了可選擇性的標記及編碼CARs擴增和自殺的啟動子。

研究表明，CAR設計和內在特性也會影響CAR修飾免疫細胞的擴增和持久性。目前，包含CD3-ζ信號結構域和共刺激結構域(通常為CD28或4-1BB)的第二代CARs仍然是臨床使用中最常見的核酸構建體。此外，研究發現，采用CD28作為共刺激分子時，T細胞雖然殺傷作用強但持續時間短，而采用4-1BB作為共刺激分子時，T細胞雖然持續時間長但殺傷能力有限。

因此，現有的嵌合抗原受體免疫細胞療法在用于腫瘤治療上仍有許多不盡理想之處。例如CAR-T細胞治療過程中會出現多種不良反應，包括細胞因子釋放綜合征等。而且由于這些毒副反應的臨床表現往往錯綜復雜，變化多端，進展迅速；而且每種CAR修飾細胞制品因為生產工藝或CAR結構的不同有著獨特不同效應特征，有待進一步充分的認識及精確的評估。

【發明內容】