[發(fā)明專利]一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210146015.3
• 申請(qǐng)日: 2022-02-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114470183A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 倪宏波;劉行波;翟軍軍;葉超;王金良;張曉軒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué);榆林學(xué)院;西南大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/245
• 分類號(hào): A61K39/245;A61K47/42;A61K47/36;A61K47/60;A61P31/22;C07K14/03;C12N15/38;C12N15/85
• 代理公司: 北京圣州專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11818
• 代理人: 王振佳

本發(fā)明公開(kāi)了一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV?1病毒粒子的制備，步驟如下：S1、合成牛皰疹病毒gB、gC、gD蛋白基因；S2、構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒；S3、真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞；S5、真核表達(dá)蛋白純；S7、右旋糖酐磁珠磁珠模擬BoHV?1病毒粒子制備。本發(fā)明采用上述的一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV?1病毒粒子的制備與應(yīng)用，通過(guò)將囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制備出粒徑小，卻具有近乎BoHV?1完整抗原性的亞單位疫苗，同時(shí)通過(guò)PEG化還可以延長(zhǎng)蛋白在體內(nèi)的存在時(shí)間，來(lái)延長(zhǎng)免疫反應(yīng)持續(xù)期。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)

Ⅰ型牛皰疹病毒(BoHV-1)主要通過(guò)呼吸道、生殖道等粘膜系統(tǒng)感染、在體內(nèi)躲過(guò)機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，進(jìn)而在體內(nèi)擴(kuò)散，最終到達(dá)三叉神經(jīng)節(jié)處定植。在機(jī)體免疫力低下時(shí)，再次反復(fù)感染，而引起發(fā)病和疾病傳播。由此，開(kāi)發(fā)通過(guò)呼吸道或者生殖道免疫的疫苗的同時(shí)，還需要開(kāi)發(fā)通過(guò)粘膜系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)引起體液和細(xì)胞免疫的疫苗，才能從根本上預(yù)防病毒。

目前，滅活疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗均不能達(dá)到以上目的。近年來(lái)，納米材料為藥物和疫苗遞送研究提供了全新的設(shè)計(jì)思路。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備與應(yīng)用，選定BoHV-1gB、gC和gD蛋白作為亞單位疫苗抗原，通過(guò)將囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制備出粒徑小，卻具有近乎BoHV-1完整抗原性的亞單位疫苗，同時(shí)通過(guò)PEG化還可以延長(zhǎng)蛋白在體內(nèi)的存在時(shí)間，來(lái)延長(zhǎng)免疫反應(yīng)持續(xù)期。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種右旋糖酐磁珠模擬BoHV-1病毒粒子的制備，步驟如下：

S1、合成牛皰疹病毒gB、gC、gD蛋白基因

按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各個(gè)基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位點(diǎn)，其下游加入AgeⅠ酶切位點(diǎn)，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，其下游加入BSTBⅠ酶切位點(diǎn)；

S2、構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒

合成基因與pcDNA4-Myc-his真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切后連接構(gòu)建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)以后，挑菌純化后大量培養(yǎng)使用英國(guó)biological tool無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取以上真核表達(dá)質(zhì)粒；

S3、真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞

用PEI磁珠質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法將以上真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞系；

S4、構(gòu)建真核表達(dá)細(xì)胞系

轉(zhuǎn)染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培養(yǎng)基37℃5％CO₂培養(yǎng)48h將未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞殺死；

S5、真核表達(dá)蛋白純

收取細(xì)胞培養(yǎng)上清和轉(zhuǎn)染成功MDBK細(xì)胞，MDBK細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，12000*g離心30分鐘沉淀細(xì)胞碎片收取上清用于下步純化；

S6、真核表達(dá)蛋白鑒定；

S7、右旋糖酐磁珠磁珠模擬BoHV-1病毒粒子制備。

優(yōu)選的，步驟S3中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的操作如下：

A、貼壁轉(zhuǎn)染

1)細(xì)胞按照傳代步驟操作，10⁵個(gè)/mL鋪6孔板貼壁鋪滿孔后開(kāi)始轉(zhuǎn)染；

2)DNA與PEI磁珠無(wú)菌混合后用無(wú)菌ddH₂O稀釋5倍后備用；